ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 18642—2021 代替GB/T18642—2002 旋毛虫诊断技术 Diagnostic techniques for Trichinella spp. 2021-11-01实施 2021-04-30发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18642—2021 目 次 前言 引言 IV 1 范围 2 规范性引用文件 3术语和定义 4 缩略语 5 压片镜检法 6集样消化法 7 酶联免疫吸附试验法（ELISA法）： 8荧光免疫层析试纸卡法 9多重聚合酶链式反应法（多重PCR法） 10综合判定 附录A（规范性附录）压片镜检法溶液配制及判定示意图· 13 附录B（规范性附录） 消化液配制 14 附录C（资料性附录） 旋毛虫集样消化法流程图 15 附录D（规范性附录) 酶联免疫吸附试验用溶液配制 16 附录E（规范性附录） 荧光免疫层析试纸卡试验用溶液配制 18 附录F（资料性附录） 荧光免疫层析试纸卡结构及判定示意图 19 附录G（规范性附录） 多重PCR法用溶液配制 20 参考文献 21 GB/T18642—2021 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18642—2002《猪旋毛虫病诊断技术》，与GB/T18642—2002相比，除编辑性修 改外主要技术变化如下： 一增加了规范性引用文件（见第2章）； —增加了术语和定义（见第3章）； 一增加了缩略语（见第4章）； 录 D); 增加了荧光免疫层析试纸卡诊断方法、荧光免疫层析试纸卡试验用溶液配制、荧光免疫层析试 纸卡结构及判定示意图（见第8章、附录E和附录F）； 一增加了用于旋毛虫虫种鉴定的多重聚合酶链式反应（多重PCR)诊断方法、多重PCR法用溶 液配制（见第9章、附录G)； 增加了综合判定（见第10章）； 一增加了压片镜检法溶液配制及判定示意图（见附录A） -增加了消化液的配制（见附录B)； 增加了旋毛虫集样消化法流程图（见附录C） 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：吉林大学、中国动物卫生与流行病学中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防 控制所。 本标准主要起草人：刘明远、刘晓雷、王媛媛、吴秀萍、董雅琴、白雪、王学林、唐斌、杨勇、丁静 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18642—2002。 II GB/T18642—2021 引言 旋毛虫（Trichinellaspp.）由英国学者JamesPanesPaget于1835年首次在伦敦一人户体内发现 同年RichardOwen把该病原定名为Trichinellaspiralis。目前，旋毛虫经种属鉴定已发现9个种及 3个尚未明确的基因型。旋毛虫是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，可感染人和150多种动物，主要 通过生食或半生食寄生有活旋毛虫的肉类（如猪肉、马肉、犬肉及野生动物肉等）而引发。人旋毛虫病 （HumanTrichinellosis）的潜伏期长达2周～4周，死亡率2%～30%。该病被世界动物卫生组织 （WorldOrganizationforAnimalHealth，OIE）列为屠宰动物（尤其是猪、马）强制性必检病种，是目前世 界范围内投人控制费用最高的人兽共患病。我国《一、二，三类动物疫病病种名录》将其列为二类动物 疫病。 本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2017版（ManualofDiagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals，2017）、国际旋毛虫病委员会（International Commission on Trichinellosis，ICT)《血清学试验检测动物和人体旋毛虫感染的建议》2018版（Recommendationson the use of serological tests for the detection of Trichinella infection in animals and humans,2018)和 《旋毛虫肌幼虫基因分型建议》2o18版（RecommendationsforgenotypingTrichinellamusclestagelar- vae，2018）相关国际标准。血清学诊断增加了酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光免疫层析试纸卡两种 技术，血清学诊断技术判定为旋毛虫感染阳性或疑似阳性的样本可进一步通过消化法确证；分子生物学 诊断增加了多重聚合酶链反应（多重PCR）技术。 IV GB/T18642—2021 旋毛虫诊断技术 1范围 （ELISA）、荧光免疫层析试纸卡、多重聚合酶链式反应（多重PCR）检测方法的技术要求和操作规范 本标准适用于猪产地检疫、屠宰加工、流行病学调查和进出口检验检疫，以及其他动物及其肉类的 旋毛虫诊断。所列方法包括病原学、血清学及分子生物学诊断，其中： 压片镜检法及集样消化法适用于猪及其他动物体的旋毛虫诊断； 一ELISA及荧光免疫层析试纸卡方法适用于猪及其他动物活体及体的旋毛虫筛查； 一多重PCR方法适用于旋毛虫分离株种属及基因型的鉴定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 集样消化 pooled digestion 混合多个动物肌肉样本，在一定温度和pH值条件下，用一定浓度的胃蛋白酶溶液，溶解其肌细胞、 3.2 排泄分泌物 excretory-secretoryproducts 旋毛虫通过表皮分泌或通过消化道排出的各种分子产物。 3.3 包囊cysts 旋毛虫侵人宿主肌细胞后，在虫体周围形成的由胶原纤维构成的、逃避宿主免疫攻击的囊壁 3.4 肌幼虫 musclelarvae 寄生于宿主肌细胞时期的旋毛虫幼虫。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DMEM：杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEaglemedium） EDC：1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺[1-（3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide」 ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay） 1 GB/T18642—2021 HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] IL-ESP：肠道期幼虫排泄分泌物（intestinallarvae-excretory/secretoryproducts） MES:2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonicacid) ML-ESP：肌幼虫排泄分泌物（musclelarvae-excretory/secretoryproducts） NHS：N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsalinebuffer） SD：标准差（standarddeviation) 5压片镜检法 5.1器材 5.1.1正置生物显微镜 5.1.2手术剪、镊子。 5.1.3夹压玻璃板。 5.1.4 微量可调移液器（200μL）。 5.2试剂 5.2.1盐酸溶液，见附录A的A.1。 5.2.2本标准所有试验用水均应符合GB/T6682中一级水标准 5.3操作方法 5.3.1样本采集 从完整嗣体两侧的横隔膜肌脚部各采样一块，记为一份肉样，其质量不少于50g，编号与躺体号码 相同。不完整嗣体，可从肋间肌、腰肌、咬肌、舌肌采样。 5.3.2样本处理 剥离脂肪和结缔组织，用剪刀顺肌纤维方向，按随机采样的要求，从样本上至少剪取28粒燕麦粒 (2mmX10mm）大小的肉样，将肉样均匀地放置在夹压玻璃板上，排成一排，每个夹压玻璃板可放置 16粒。 5.3.3压片 将另一夹压玻璃板重叠在放有肉样的玻璃板上，并旋动螺丝，加压使肉粒压成半透明薄片。 5.3.4镜检 将制好的压片放在低倍显微镜下（放大倍数4×10），从压片一端边沿开始观察，直到另一端为正。 不清晰处，可在10×10的放大倍数下进一步观察。 5.4结果判定 5.4.1肌细胞内有圆形或椭圆形包囊，且包囊中央有蜷曲的虫体，判定为形成包囊的旋毛虫。旋毛虫 包囊镜下判定示意图见图A1。 5.4.2肌细胞内有呈直杆状或略蜷曲状态虫体，判定为无包囊的旋毛虫。无包囊旋毛虫镜下判定示意 图见图A.2。 2 GB/T18642—2021 5.4.3发现数量不等、浓淡不均的黑色钙化物，可开启夹压玻片，加入少许10%的盐酸溶液，静置1min～ 2min后，再行观察，结果判定同5.4.1和5.4.2。 5.4.4 发现形成包囊的旋毛虫和无包囊的旋毛虫均判定为旋毛虫感染 6 集样消化法 6.1 器材 6.1.1 手术剪。 6.1.2 不锈钢筛网（筛孔直径180μm）。 6.1.3 漏斗。 6.1.4 分液漏斗。 6.1.5 烧杯(1L和3L)。 6.1.6 离心管（50mL）。 6.1.7 电动刀式绞肉机或碎肉机（孔径≤3mm）。 6.1.8 温度计。 6.1.9 磁力搅拌器和转子。 6.1.10 恒温培养箱。 6.1.11 倒置显微镜。 6.1.12 培养皿（带标尺）。 6.2 试剂 6.2.1 盐酸水溶液,见附录B的B.1。 6.2.2 消化液，见B.2。 6.3 操作流程 操作流程见附录C的图C.1。 6.4 操作方法 6.4.1 样本采集 6.4.1.1 采集部位 猪主要采集隔肌脚和舌肌，其他动物采集部位见表1。 表1不同被检宿主可选择的肌肉样本 主要选择的肌肉 宿主种类 检测质量/g 猪 隔肌、舌肌 3~5 马 咬肌、舌肌 5~10 犬 隔肌、咬肌、舌肌 5~10 野猪 隔肌、肠肌、舌肌 5~10 熊 膈肌、咬肌、舌肌 10 海洋哺乳动物 膈肌、舌肌、鳍肌 10 （海豹、海象） 鳄鱼 咬肌、肋间肌 10 其他野生肉食动物 舌肌、排肠肌 10 3