ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T_18647—2020 代替GB/T18647—2002 动物球虫病诊断技术 Diagnostic techniques for animal coccidiosis 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18647—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T18647—2002《动物球虫病诊断技术》。本标准与GB/T18647—2002相比，除编 辑性修改外，主要技术变化如下： “范围”部分增加了家畜（猪、牛、羊、马等）和宠物（犬、猫等）（见第1章）； 一增加了“临床诊断”部分（见第3章）； “病原检查”部分增加了“样品采集、保存和运输”（见4.2） “定性检查阴性结果判定部分根据不同动物修改了需要连续检查粪便天数[见4.3.1.8b）， 2002年版的2.2.1.8b）； —定量检查”部分增加了不同动物粪便采集量以及卵囊OPG的换算方法（见4.3.2.2，4.3.2.7~ 4.3.2.9); 二“病理检查”中裂殖子/裂殖体检查部分增加了对免肝脏和鸭、鹅肾脏的检查（见5.3.1）； 一增加了结果“综合判定”部分（见第6章）； “球虫卵囊形态特征”部分增加了不同属球虫卵囊的大小和模式图（见附录B）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所。 本标准主要起草人：董辉、黄兵、韩红玉、陈兆国、赵其平、朱顺海， 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18647—2002 GB/T18647—2020 引言 球虫病（coccidiosis）是多种动物的一种重要寄生虫病，各国均有发生，对家畜、家禽、宠物、鱼类和野 生动物等均有不同程度的危害，特别在集约化养殖中，若控制不严，会造成重大经济损失。本病对家离 和兔危害较大，急性暴发的死亡率可超过30%；其次是猪、牛、羊等家畜，急性感染常引起下痫，生长严 重受阻；犬、猫球虫病也较为常见，可引起消瘦、贫血、腹泻及生长发育受阻，严重时可导致死亡；也偶有 鱼类和野生动物发生球虫病的报道。 本病的病原为顶复器门（Apicomplexa）、类椎体纲（Conoidasida）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美 耳科（Eimeridae）中的艾美耳属（Eimeria）、等孢属（Isospora）、泰泽属（Tyzzeria）、温扬属 （Wenyonella）球虫。每种动物都有各自特有的球虫种类，文献记录的畜禽和野生动物球虫种类已达 2000多种。国内外对球虫病的经典诊断方法是病原检查，并结合临床症状和病理剖检进行综合诊断。 尽管国内外学者建立了免疫学、血清学和分子生物学等多种诊断技术，如色素试验法、子孢子制动反应、 性DNA（RAPD）和聚合酶链式反应（PCR）等，但由于这些方法检出的准确性和操作复杂等问题，尚不 能代替现有方法。 病原检查和综合诊断技术仍是目前最常用的方法。综合诊断主要用于发病或死亡后的诊断，确定 动物或动物群是否因感染球虫而发病或死亡。病原检查简单、易行，既可定性，又可定量，既可用于发病 前，又可用于发病后，以确定动物或动物群感染球虫的程度。病原检查可广泛用于流行病学调查、防治 药物的筛选和临床验证、进出口检疫、无本病健康动物群的建立等。 为了规范球虫与球虫病的检疫方法，使得检出结果客观、准确、一致，以保证《中华人民共和国动物 防疫法》的实施，特制定本标准。 GB/T18647—2020 动物球虫病诊断技术 1范围 本标准规定了动物球虫病的临床诊断、病原检查、病理检查、综合判定的技术要求 本标准适用于家禽（鸡、鸭、鹅等）、家畜（猪、牛、羊、马、兔等）、宠物（犬、猫等）球虫病（感染）的诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3临床诊断 根据发病临床特征，球虫病可分为急性型和慢性型。 急性型多发生于幼龄动物，病程初期表现为精神沉郁，嗜睡，被毛粗乱，食欲下降，腹泻。病程后期 出现运动失调，食欲废绝，排出带血水样稀便，甚至是血便，具恶臭味，可视黏膜贫血、苍白，身体消瘦，甚 至失重，最后因脱水、衰竭而死 慢性型多见于大龄动物，无明显症状，主要表现为厌食，间歇性下痫，逐渐消瘦，生产性能下降等。 有以上临床症状者，可以怀疑为球虫病，确诊需进一步进行病原或病理检查。 4病原检查 4.1材料与试剂 4.1.1试剂：饱和盐水，2.5%重铬酸钾溶液，配制方法分别见附录A中A1和A.2，配制用水符合 GB/T6682—2008三级水要求。 4.1.2器材：样品保存袋、记号笔、防水标签纸、60目和100目铜丝网或尼龙网、100mL量筒、50mL烧 杯、50mL离心管、10mL玻璃瓶、吸管、镊子、天平、离心机、麦氏虫卵计数板、载玻片、盖玻片、显微 镜等。 4.2样品采集、保存和运输 4.2.1动物粪便的采集：对家禽、犬、猫、兔等小型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于200g，若 是个体采样，采集新鲜粪便不少60g；对猪、牛、羊、马等大型动物，若是群体采样，采集新鲜粪便不少于 300g，若是个体采样，采集新鲜粪便不少100g。 4.2.2样品的保存：样品采集后置于样品保存袋中，封口后，每份样品的包装袋上均要贴上标签，写明 采集地点、采集时间、动物种类、动物年龄、粪便性状等详细资料，置于2℃～8℃冰箱内保存。 4.2.3样品的运输：以最快最直接的途径将所采集的样品送往实验室进行检测，运输条件符合NY/T541- 2016要求。 1 GB/T18647—2020 4.3操作方法 4.3.1定性检查 4.3.1.1将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取10g，放入50mL烧杯中，加人适量水。 网或尼龙网过滤。 4.3.1.3将滤液移人50mL试管，2500r/min离心10min。 4.3.1.4 倾去上清液，沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀，将管内的沉淀物混悬液移人10mL玻璃 瓶内。 4.3.1.5 用饱和盐水加满玻璃瓶，盖上盖玻片（盖玻片应与液面接触），静置10min。 4.3.1.6 取下盖玻片，将有液体的一面盖在载玻片上。 4.3.1.7 置载玻片于显微镜载物台上，用10×10或10×40的倍数进行检查。 4.3.1.8 定性检查的判定标准如下： a） 发现球虫卵囊，判为阳性，说明该动物（群）已感染球虫。将球虫阳性粪样置于2.5%重铬酸钾 溶液中，在25℃～28℃环境中培养至孢子化卵囊后，参见附录B球虫卵囊形态特征，确定为 哪一属的球虫。 b) 未发现球虫卵囊，需从4.3.1.1开始重复检查5次，仍未见球虫卵囊，该粪样可判为阴性。对于 （群）未感染球虫；而对于猪、牛、羊、马、免等家畜，需连续采集粪便14d～21d，每天检查，均未 发现球虫卵囊，说明该动物（群）未感染球虫。 4.3.2定量检查 4.3.2.1对定性检查中呈阳性的粪样，需进行定量检查。 4.3.2.2每份粪样取3个重复，每个重复根据待检动物种类不同取不同粪便量，家禽、犬、猫、免等小型 动物取粪样2g，猪、牛、羊、马等大型动物取粪样10g，放人50mL烧杯 4.3.2.3加入适量自来水搅匀，经60自铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗3次～5次滤网；对于 猪、牛、羊、马等大型动物，滤液再经100目铜丝网或尼龙网过滤，用少量自来水冲洗3次～5次滤网。 4.3.2.4将滤液移人50mL试管，2500r/min离心10min，弃去上清液。 4.3.2.5用少量饱和盐水将沉淀物搅匀，移人100mL量筒，加饱和盐水至60mL处，充分混匀。 4.3.2.6 用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板的2个计数室，静置5min。 4.3.2.7 将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查，用10×10的倍数数出每个计数室（1cm×1cm× 0.15cm=0.15cm）内的所有卵囊数，将两个计数室的卵囊数之和除以2即得卵囊平均值。对压线的 卵囊，按左、上压线计，右、下压线不计处理。根据每个重复的卵囊平均值，计算出三个重复的平均 值A。 4.3.2.8家禽、犬、猫、兔等动物的每克粪便卵囊数（oocystpergram，OPG)按式（1）计算，猪、牛、羊、马 等动物的OPG按式（2)计算： OPG=(A=0.15)X60-2=AX200 ......(1) OPG=(A-0.15)×60-10=A×40 ....（2) 4.3.2.9对卵囊数较多的粪样，可在60mL总体积的基础上，用饱和盐水再稀释B倍后计数，家禽、犬、 猫、兔等动物的OPG按式（3)计算，猪、牛、羊、马等动物的OPG按式（4)计算： OPG=AX200XB ...(3 ) OPG=AX40XB .....(4) 4.3.2.10定量检查的判定标准如下： SAC a）OPG>10×10°为严重感染； 2 GB/T18647—2020 b）1×10t≤OPG≤10×10，为中度感染； c)（ OPG<1X10，为轻度感染。 5病理检查 5.1# 材料准备 5.1.1磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见A.3，配制用水符合GB/T6682一2008三级水要求。 5.1.250mL或100mL烧杯、吸管、手术剪刀、镊子、玻片、盖玻片、显微镜、研钵等。 5.1.3疑为发生球虫感染致死或将要死亡的动物。 5.2病变检查 5.2.1对疑为球虫感染致死或将要死亡的动物进行解剖，观察病变情况。 5.2.2主要检查球虫寄生部位（器官）的病变。大多数的球虫寄生于肠上皮细胞，若肠道明显肿大、胀 气或变形，肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色、褐色或白色的斑点或斑块或结节；肠内容物充满血凝 块、脱落的上皮细胞、纤维素样物、黏液等，呈暗红色、橙黄色或乳白色，多为稀薄状；肠黏膜增厚，有坏死 的病灶等，可疑为球虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。 5.2.3对免，还应检查肝脏；对鸭、鹅，还应检查肾脏；若这些脏器上有灰白色的斑点或斑块，可疑为球 虫病，进一步做裂殖子、裂殖体或卵囊检查。 5.3裂殖子/裂殖体检查 5.3.1取病变明显的肠道，纵向剪开，用磷酸盐缓冲液轻轻洗去黏膜表层的杂物，刮取少许黏膜；对免 或鸭、鹅，还应分别刮取肝脏或肾脏灰白色的斑点或斑块 5.3.2将刮取物放在载玻片上，滴1滴～2滴磷酸盐缓冲