ICS 07.08C A 21 民共和国国家标准 GB/T 38477—2020 廿±的测定 蛋白印逊法 :expression-Westernblot 2020-11-19实施 2020-11-19发布 国宝市场监营宫埋总局 发布 示准化管理委员会 GB/T38477—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发 育生物学研究所农业资源研究中心、中国医科大学、河北师范大学。 本标准主要起草人：吕品、马爱进、张岩、赵伟东、曹鹏秀、赵美丞、王宁。 1 GB/T 38477—2020 基因表达的测定 蛋白印迹法 1范围 本标准规定了用蛋白印迹（Westernblot）法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测 定步骤和结果分析。 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 基因表达 geneexpression 将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin） ECL：增强型化学发光(EnhancedChemiluminescence) SDS：十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate) SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGel Electrophoresis) TBS:Tris缓冲盐溶液（TrisBufferedSaline) TBST：吐温-20/Tris缓冲盐溶液（Tween-20/TrisBufferedSaline) 4原理 SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后，先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反 应，然后利用带标记的二抗与一抗反应，最后根据二抗标记物的特性，检测微量蛋白质， 1 GB/T38477—2020 5试剂或材料 5.1总则 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.2水 GB/T6682,二级 5.3 31mol/LTris-盐酸溶液 称取12.1gTris加入80mL水溶解，用盐酸调至所需pH，加水定容至100mL。 5.42mol/L氯化钠溶液 将117g氯化钠加水溶解，定容至1000mL。 5.5 后定容至100mL。 5.6 6动物细胞/组织总蛋白裂解液 取5mL1mol/LTris-盐酸溶液（pH8.0）、7.5mL2mol/L氯化钠溶液、1mL0.5mol/L乙二胺 四乙酸溶液、1mL乙基苯基聚乙二醇、0.1g十二烷基硫酸钠、1g脱氧胆酸钠、加水定容至100mL。使 用前加入蛋白酶抑制剂。 5.7植物总蛋白抽提试剂盒 含裂解液和蛋白酶抑制剂。 5.8 31.5mol/LTris-盐酸(pH8.8)溶液 SAC 将18.15gTris加人80mL水溶解，用1mol/L盐酸调pH至8.8，加水定容至100mL。 5.9 丙烯酰胺溶液 称取29g丙烯酰胺单体和1gN，N-甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL，过滤，置于棕色 瓶，4℃避光保存，2个月内使用。 5.100.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液 称取10g十二烷基硫酸钠，加水溶解并定容至100mL，室温保存。 5.110.1g/mL过硫酸铵溶液 称取1g过硫酸铵，加水溶解并定容至10mL，分装后，于一20℃保存。 5.12蛋白浓度测定试剂盒 含蛋白质标准品BSA和染料试剂 2 GB/T 38477—2020 5.135×SDS上样缓冲液 取2.5mL1mol/LTris-盐酸(pH6.8)缓冲液、2g十二烷基硫酸钠、1.2mLβ-巯基乙醇、4mL甘 油、0.2g溴酚蓝加人水中溶解，定容至40mL。 5.145×SDS-PAGE电泳缓冲液 称取23.5g甘氨酸和3.775gTris，加水溶解，定容至250mL。使用时按如下比例稀释至使用浓 度：取133mL5XSDS-PAGE电泳缓冲液，7mL0.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液，加水定容至700mL。 5.15转膜缓冲液 称取3.03gTris，14.4g甘氨酸，加水溶解，再加200mL甲醇混匀，定容至1L，4℃保存。 5.16TBS溶液 量取75mL2mol/L氯化钠溶液和10mL1mol/LTris-盐酸（pH7.5）缓冲液，加水定容至1L。 5.17TBST溶液 量取75mL2mol/L氯化钠溶液、10mL1mol/LTris-盐酸（pH7.5）缓冲液和1mL吐温-20,加 水定容至1L。 5.18 封闭液 称取5g脱脂奶粉，溶于100mLTBST溶液，混匀，现用现配 6 仪器设备 6.1 电泳仪。 6.2 转膜仪。 6.3 垂直电泳槽。 分析天平，感量0.001g。 6.5 平板摇床。 6.6 低温离心机，最大离心力25910g。 6.7 化学发光仪/红外荧光成像系统。 6.8 振荡器。 真空干燥器。 6.10 2.45mm超厚滤纸。 6.11 1.5mL离心管。 6.12 磁力搅拌器。 7测定步骤 7.1总蛋白的提取 7.1.1动物总蛋白的提取 将20mg体外培养的细胞或研碎的组织转移至1.5mL的离心管中,加150μL～250μL预冷的细胞裂 3 GB/T38477—2020 解液（含蛋白酶抑制剂），振荡器震荡15s，冰浴5min，重复震荡-冰浴30min后，4℃，12000r/min离心 10min，得上清液。 7.1.2植物总蛋白的提取 按照植物总蛋白提取试剂盒说明进行。 7.2 蛋白浓度的测定 按照蛋白浓度测定试剂盒说明进行。 7.3SDS-PAGE 7.3.1蛋白变性 测完蛋白浓度后，计算含100g总蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品于离心管中，加人 5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，将样品于沸水中煮3min~5min使蛋白质变性。 7.3.2制胶 根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度，参见附录A。 7.3.3上样 取7.3.1的蛋白样品上样，相邻齿道加上标准分子量预染蛋白，空余齿道用1×上样缓冲液补足 体积。 7.3.4电泳 选择电压为8V/cm，当染料进人分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直到漠酚蓝达到分离 胶底部，然后关闭电源。 7.4转膜 7.4.1凝胶准备 将进行完SDS-PAGE后的凝胶浸泡于转膜缓冲液中30min。 7.4.2半干法转移蛋白质 将转印膜和两张与转印膜相同尺寸的滤纸于转膜缓冲液中浸泡5min。由下至上安装转移装置： 阳极板一超厚滤纸一转印膜一凝胶一超厚滤纸一阴极板，根据凝胶面积按0.65mA/cm²接通电流，根 据目的蛋白相对分子量大小，转移1.5h～3h。 7.5封闭 将转印膜置于封闭液中，室温摇动1h。 7.6 免疫反应 将封闭后的转印膜转移到一抗工作液中，室温下摇动1h以上或4℃缓慢摇动过夜。弃去一抗工 作液，用TBST摇动洗涤转印膜3次，每次10min，最后用TBS摇动洗涤转印膜5min。 将转印膜置于二抗工作液中，室温下摇动1h～3h。弃去二抗工作液，以TBST摇动洗涤转印膜 3次，每次10min，最后用TBS摇动洗涤转印膜5min。 4 GB/T38477—2020 7.7成像 7.7.1辣根过氧化物酶标记二抗的成像 取ECL化学发光液A，B等量混匀，加在转印膜上，避光显色1min5min，化学发光仪成像 7.7.2 2荧光标记二抗的成像 利用荧光成像系统成像。 3结果分析 蛋白表达 5