ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38481—2020 微生物超低频突变测定 双重测序法 Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms- Duplex sequencing 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38481—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、江汉大学、中国标准化研究院 本标准主要起草人：张独、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、彭海、马爱进 GB/T 38481—2020 微生物超低频突变测定 双重测序法 1范围 本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法。 本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 超低频突变 Eultralow-frequencymutations 化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生的频率低于1X10-5的永久性改变。 3.2 条形码标签 Ebarcodelabel 接在待测DNA片段两侧的核苷酸片段，用以标示同一扩增家族的DNA，协助进行突变位点的 确认。 3.3 互补标签家族 complementarytagfamily 所有含两端互补条形码标签的DNA片段 3.4 双链同源序列（ double-strand consensus sequences;DCSs 带有相同条形码标签的双链DNA序列，包含反向互补链 4原理 在待测DNA片段两端接上一段12nt随机且互补的双链核苷酸条形码标签，然后对所有带有条形 码标签的序列进行双重的高通量测序。利用12nt随机互补标签，排除掉测序文库制备过程中所引入 的突变，进而准确检测突变位点和突变率。 5 试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1 水。GB/T6682，一级。 5.2接头链标签序列： 1 GB/T 38481—2020 a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’; b)5-TCTTCTACAGTCANNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3° N为A、T、C或G，由12个随机碱基组成标签片段。 将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液（5.8）或纯水中至终浓度100μmol/L，并放置于一20℃ 保存。 5.3接头链扩增引物序列： a）5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3'; b）5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3'。 X为按样品需求设计的文库标记序列。 将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液（5.8)或纯水中至终浓度20μmol/L，并放置于一20℃保存。 5.4基因提取试剂盒。 5.5高通量测序建库试剂盒。 5.6DNA分选磁珠试剂盒 5.7DNA分析试剂盒。 5.8 3三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA)缓冲液，pH8.0。由10mmol/L的分析纯Tris和 0.1mmol/L的EDTA配制，调整pH值至8.0。 仪器设备及器具 6 6.1PCR扩增仪。 6.2磁性分离器。 6.3高通量测序仪。 6.4 核酸分析系统。 电子天平：精度为0.01g。 7 样品制备 7.1DNA提取 5OL的无菌双蒸水进行DNA洗脱。提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度。 7.2DNA片段化和末端修复 利用高通量基因测序建库试剂盒，将待测样品DNA片段化至100bp～1000bp，将末端修复为 A尾。 8接头条形码标签的合成 8.1退火 将浓度100μmol/L的两个接头链寡核苷酸片段各取100μL进行退火，在95℃下加热5min后， 自然降温，并静置1h。 8.2 延伸 将8.1中得到的产物按试剂说明与脱氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTPs）和克列诺酶混合均匀，分 装至两个0.2mL的PCR管中并在37℃下孵育1h。 2 GB/T384812020 8.3DNA回收 使用无水乙醇沉淀DNA，并加入200μL纯水溶解。 8.4酶切 用限制性内切酶HpyCH4IⅢI对DNA产物进行酶切。将混合物分装至4个0.2mL的PCR管中， 并在37℃孵育16h。 8.5纯化 加人并均匀混合50μL的3mol/L乙酸钠溶液（pH5.2），最终体积为550μL。将混合溶液平分到 1.5mL的具塞离心管内，每管275μL，并加入625uL室温的无水乙醇到各管中。充分混匀，并以大于 10000r/min的转速在4℃下离心30min。 移除上清液后，加入1mL的75%（体积分数）乙醇至各管中。充分混匀，并立即以大于10000r/min 的转速在4℃下离心30min。 移除上清液后，在纸巾上倒置试管10min以干燥，接着正置5min。 加人100μL的Tris-EDTA缓冲液至上一步骤产物中并混合均勾。将所有试管集在一起，最终体 积为200μL，终浓度约为50μmol/L，放人一20℃的冰箱中保存。 9接头条形码标签与待测样本DNA的连接和扩增 9.1连接 将互补条形码标签与DNA片段化和末端修复产物按总浓度20：1混合后，利用T4DNA连接酶 连接，在25℃孵育15min。 9.2分选 利用DNA分选磁珠试剂盒分选得到的产物，获得长度为200bp～900bp的DNA片段，并以DNA 试剂盒定量DNA浓度。 9.3PCR扩增 以分选产物为模板，接头链扩增引物序列为引物，按每20万读数数据量取1amolDNA样量进行 PCR扩增，扩增程序根据所选用高保真DNA聚合酶的要求设定。 10高通量测序 为大于或等于10 Gb。 11结果分析 对高通量测序数据进行清理，然后按下列程序进行数据分析： a） 根据随机标签进行互补标签分类，每个家族需包含双向互补序列。互补标签家族大小分布 在排除1之后，最大峰值分布应于612之间。 b）双链同源序列在同一位点识别出突变才视为真正的突变位点 GB/T38481—2020 12 结果计算与表述 12.1 结果计算 突变率按式(1)计算： Nm M = ....(1) N. 式中： M 突变率； Nm——双链同源序列突变位点数； N.——不含标签的测序核苷酸总数。 12.2 结果表述 结果表述为待测样本的突变率M。 GB/T38481—2020 12 结果计算与表述 12.1 结果计算 突变率按式(1)计算： Nm M = ....(1) N. 式中： M 突变率； Nm——双链同源序列突变位点数； N.——不含标签的测序核苷酸总数。 12.2 结果表述 结果表述为待测样本的突变率M。