ICS 65.020.30 B 44 中华人民共和国国家标准 GB/T38740—2020 实验动物 猴马尔堡病毒检测方法 Laboratory animalMethod for examination of simian Marburg virus (MARV) 2020-08-01实施 2020-04-28发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38740—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)提出并归口 本标准起草单位:海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民 共和国成都海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、 中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。 本标准主要起草人:李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。 1 GB/T38740—2020 实验动物猴马尔堡病毒检测方法 1范围 本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 马尔堡病毒 Marburgvirus 种高致病性病毒,属丝状病毒科(Filoviridae),单股负链RNA病毒,基因组约19.1kb,为已知的 最大的负链RNA病毒。 3.2 逆转录实时荧光聚合酶链式反应 real-time quantitative reverse transcription polymerase chain re- action;real-time RT-PCR 将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加人一对引 物的同时加入一条特异性的荧光探针,该探针为一寡核酸片段,两端分别标记一个报告荧光基团和一 个萍灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被萍灭基团吸收;PCR特异性扩增时,Taq酶 的5°-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收 到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 3.3 噪音noise 荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。 3.4 Ct 值 cyclethreshold value 从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1 GB/T38740—2020 DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein) MARV:马尔堡病毒(Marburgvirus) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chainreaction) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate) TAMRA:6-羧基四甲基若丹明(6-carboxytetramethylrhodamine) Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] 5试剂或材料 本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求 5.1 裂解液:Trizol或其他等效裂解液。 5.2 三氯甲烷:异戊醇:体积比24:1。 5.3异丙醇:-20℃预冷。 5.4磷酸盐缓冲液(PBS):见附录A中的A.1。 5.5 5无RNase水:见A.2。 5.6 75%乙醇:见A.3。 5.7 逆转录酶:一20℃保存,避免温度剧烈变化。 5.8 10XRT-PCR缓冲液。 5.9 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。 5.10 MgCl2:25mmol/L。 5.11 TagDNA聚合酶:一20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 5.12 RNA 酶抑制剂。 5.13 阳性对照:体外转录的、非感染性的、猴马尔堡病毒阳性RNA片段,DNA序列参见附录B。 5.14 阴性组织对照:猴马尔堡病毒阴性组织样品。 5.15 引物和探针,浓度为10μmol/L,序列如下: 上游引物 MARV-F:5'-TTG GTG CGG ACC TCC AAA GT-3'; 下游引I物MARV-R:5-GCGCAATTGCTGAGAGCTGA-3: 探针:5'-FAM-AGCAGGCGTTGAGCAACCTAGCCCGA-BHQ1-3'。 6仪器设备 6.1荧光定量PCR核酸扩增仪。 6.2生物安全柜。 6.3电子天平。 6.4高速冷冻离心机,台式离心机。 6.5冷藏冷冻冰箱。 6.6组织匀浆器。 6.7旋涡振荡器。 2 GB/T38740—2020 6.8微量可调移液器:2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 6.9低温冰箱,温度≤一70℃。 7样品采集 7.1生物安全要求 样品的采集、保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护,并符合GB/T18088的相关要求。 7.2取样工具 棉拭子、剪刀、镊子、离心管、一次性无菌注射器,上述取样工具应无菌。 7.3血液样品 用无菌注射器直接吸取血液至1.5mL无菌抗凝离心管中,编号备用。 7.4肛拭子或者粪便 将灭菌的棉子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动,然后将拭子放入装有1.5mLPBS的离心管 内,加盖、编号。棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后,于离心机中瞬时离心,立即使用或 一20℃备用。 7.5内脏样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏、肾脏、心脏或者脾脏约2.0g于组织匀浆器中,加人 无菌1.5mL离心管中,编号备用。 7.6存放和运送 反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室。 8试验步骤 8.1实验室生物安全要求 8.2样本核酸提取 8.2.1在样本处理区进行。为防止RNA降解,所用试验用具及溶液应无RNA酶,操作过程中应佩戴 一次性橡胶或乳胶手套。 8.2.2取200μL病毒液或已处理好的样品加人到无RNA酶的1.5mL离心管中,加人600μLTrizol 试剂,用旋涡振荡器剧烈振荡15s后,室温放置5min。 8.2.3加人200uL三氯甲烷,用旋涡振荡器剧烈振荡15s后室温放置3min,4℃,12000g离心 15 min。 SAG 3 GB/T38740—2020 匀,室温放置10min。 8.2.54℃,12000g离心15min,弃上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将液体去除。 8.2.6加人1000uL预冷的75%乙醇,缓慢颠倒洗涤沉淀。 8.2.74℃、12000g离心15min,弃上清液,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥沉淀5min~ 10 min. 8.2.8加入20μLDEPC水,溶解沉淀后,室温孵育10min。提取的RNA应在2h内使用或一70℃冰 箱保存备用。 8.2.9在实验过程中,同时设置阴性对照和以DEPC水空白对照。 8.2.10可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法 8.3反应体系 取出相应的荧光RT-PCR试剂、引物探针等,在室温下融化后,2000g离心5s。按样品数量配制 反应液,每个反应管包含:10o×RT-PCR缓冲液2μL,25mmol/LMgCl²2μL,2.5mmol/LdNTPs 1.5μL,10μmol/L上下游引物各1μL,10μmol/L探针0.5μL5U/μLDNA聚合酶0.5μL,5U/μl 逆转录酶0.5μL,40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL,DEPC水6.5μL。充分混合均匀,向每个反应管中 各分装16μL,转移至样本处理区,最后加人总RNA4μL。 实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。 8.4反应程序 50℃反转录30min;95℃预变性5min;95℃变性15s,61℃退火30s,收集荧光,共32个循环。 同时设阳性对照、阴性对照和空白对照,记录Ct值。可根据不同仪器要求将反应程序做适当调整。 8.5结果判定 8.5.1结果分析条件设定 综合分析仪器给出的各项结果,基线以仪器给出的默认值作为参考,阈值设定原则以阈值线刚好超 8.5.2质控标准 阳性对照样品有对数扩增曲线,而且Ct值<28。 阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线。 二者均成立才可判定试验成立。 8.5.3结果描述及判定 检验样本Ct值≤28,且出现典型的扩增曲线,则判定MARV阳性。 检验样本28<Ct值≤32时,重复一次,如果Ct值仍然≤32,并且曲线有明显的对数增长期,则判 定MARV阳性;否则判定MARV阴性 样本Ct值为零或Ct值>32时,则判定MARV阴性。 4 GB/T38740—2020 附录A (规范性附录) 试剂配方 A.10.01 mol/L PBS NaCl 8.5 g KC1 0.2 g Na2HPO4: 12H20 2.8 g KH,PO4 0.2 g 将上述成分依次溶解,去离子水定容至终体积为1000mL,调pH至7.2,121℃高压灭菌20min, 室温保存。 A.2 无RNase超纯水(DEPC水) 超纯水 100 mL 焦炭酸二乙酯(DEPC) 50 mL 室温过夜,121℃,15min灭菌,或直接购买无RNase超纯水 A.3 75%乙醇 无水乙醇 7.5 mL 无RNase超纯水 2.5mL 现配现用。 5
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