) （民共 GB/T 39 ) 够 核酸 Princi tion labele 卫场监首官理芯 示准化管理委员 GB/T39512—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 因科技有限责任公司、深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、成都先导药业开发股份有限 公司、苏州金唯智生物科技有限公司、四川大学华西医院、四川农业大学、河北医科大学。 本标准主要起草人：周李华、雍金贵、韩国全、刘宗文、杨杰斌、潘红、李怀平、张懿、马丽侠、杨国武 刘倩、蒋子敬、杨丽、郝军政、郑燕燕、吕品。 GB/T 39512—2020 磷酸化标记核酸检测通则 1范围 本标准规定了磷酸化标记核酸检测的术语和定义、缩略语、一般要求、测定方法、样品保存和报告。 本标准适用于DNA编码化合物文库构建用的磷酸化标记核酸的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 GB/T30989 高通量基因测序技术规程 GB/T 34797 核酸引物探针质量技术要求 3 3术语和定义 GB/T34797界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 磷酸化标记核酸 phosphorylation labeled nucleic acid 5'端标记一个磷酸基团，长度范围在9nt～17nt的单链DNA。 3.2 DNA编码化合物DNAencodedcompound 具有5'端标记磷酸基团，3'端带有2～6个碱基黏末端，9nt～17nt的两条单链DNA退火形成的 双链。 3.3 退火annealing 两条单链DNA通过加热变性、降温复性的方式，依据碱基互补配对原则结合在一起， 3.4 互补链 complementarystrand 通过碱基互补配对形成的双链核苷酸链中的两条单链。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DIEA：N，N-二异丙基乙胺（Diisopropylethylamine） DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) EDTA：乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid) 1 GB/T39512—2020 HFIPA：六氟异丙醇（Hexafluoroisopropanol) HPLC:高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography) LC-MS：液相色谱-质谱联用仪（LiquidChromatography-MassSpectrometer) OD:光密度(OpticalDensity) TEAA：三乙基铵醋酸盐（TriethylammoniumAcetate) 5磷酸化标记核酸检测一般要求 5.1 样品要求 检测样品应为无色或浅黄色澄清液体，无悬浮物，无机械杂质。样品管保存完好，无破损、无漏液。 5.2 人员要求 进行磷酸化标记核酸检测的人员应具有生物、化学专业知识的教育背景。 5.3 3试剂要求 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 5.4检测项目 磷酸化标记核酸的检测项目参见表1，指标参数的参考结果参见附录A。 表1磷酸化标记核酸检测指标及测定仪器 样品 指标项目 测定方法 仪器设备 总量 6.1 紫外分光光度计 6.2 相对分子质量 LC-MS 6.3.2 LC-MS 碱基准确度 6.3.3 测序仪 紫外吸收强度 6.4.1 紫外分光光度计 HPLC纯度 6.4.2 纯度 HPLC仪 质谱纯度 6.4.3 LC-MS 磷酸化标记核酸 完全匹配度 6.5.2 测序仪 碱基缺失率 碱基缺失率 6.5.1 LC-MS 紫外吸收强度 6.6.1 紫外分光光度计 互补链浓度差 质谱峰强度比 6.6.2 LC-MS 6.6.3 化合物间浓度差 紫外分光光度计 脱磷酸产物占比 6.7 脱磷酸化产物 LC-MS 原料胶图转化率/ 凝胶电泳仪/ 连接效率 6.8 相对分子质量 LC-MS 2 GB/T39512—2020 6 测定方法 6.1 总量检测 按照GB/T34797执行。 6.2 2相对分子质量检测 6.2.1直接计算 相对分子质量可依据定制序列，按照式（1）直接计算： MW=(AX313.21)+(CX289.18)+(GX329.21)+(TX304.2)+79.98-61.94 .........(1) 式中: MW 相对分子质量； A,C,G,T一一各碱基相对应的碱基数； 79.98 -——5磷酸基团相对分子质量； 61.94 一磷酸二酯键残基相对分子质量。 6.2.2质谱检测 采用LC-MS对磷酸化标记核酸的相对分子质量（MW）进行检测，LC-MS通过电喷雾电离源将样 品转化为运动的带电气态离子碎片，然后按质荷比（m/）大小分离并记录，通过质谱分析软件换算出目 标化合物的相对分子质量。仪器运行前检查确认仪器的离子源、检测器、数据系统等状态正常，LC-MS 的设备参数及流动相参数参考附录B中的B.1。 6.2.3测定结果 采用6.2.2方法测得的相对分子质量（MW)与6.2.1中计算的相对分子质量(MW)进行比较得出相 对误差。 6.3碱基准确度检测 6.3.1总则 磷酸化标记核酸序列和定制序列的匹配程度，由合成仪自动生成的序列信息与质谱检测、测序检测 的结果进行比对验证。 6.3.2液相色谱-质谱法 采用6.2.2方法测定，将测得的相对分子质量与6.2.1中定制序列的理论相对分子质量（MW）进行 比对验证。 6.3.3基因测序法 按照GB/T30989执行，对磷酸化标记核酸进行序列测定。 6.4纯度检测 6.4.1紫外分光光度法 按照GB/T30988执行。 3 GB/T39512—2020 6.4.2高效液相色谱法 采用HPLC仪对磷酸化标记核酸的纯度进行测定，设备运行参数参考B.2。确保仪器状态正常后 取10μL50umol/L磷酸化标记核酸溶液和20μL超纯水置于进样瓶中混匀，点击仪器运行按钮，仪器 自动进样检测。根据检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值，得出磷酸化标记核酸的纯度。 6.4.3液相色谱-质谱法 采用6.2.2方法测定，计算目标峰质谱信号的强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出磷酸化标记 核酸的质谱纯度。 6.5碱基缺失率检测 6.5.1液相色谱-质谱法 采用6.2.2方法测定，计算缺碱基峰的质谱信号强度占所有峰质谱信号强度的比值，得出碱基缺 失率。 6.5.2基因测序法 采用6.3.3方法测定，计算碱基缺失信号比例。 6.6互补链浓度差检测 6.6.1紫外吸收强度检测 6.6.1.1单链浓度检测 采用紫外分光光度法对磷酸化标记核酸进行紫外吸收强度检测，测得核酸在260nm处的吸收强 度即OD260数值，测得的OD260数值乘以稀释倍数作为最终定量的OD260数值，用OD260数值除以消光系 数转换为样品浓度。 6.6.1.2互补链浓度差 根据单链定量结果，计算两条互补链间的浓度差。 注：检测前离心并混匀样本，样本量大时，可采用摇床600r/min，25℃，10min混匀 6.6.2质谱峰强度比检测 采用6.2.2方法测定，计算双链中含量较低的单链质谱信号强度占双链总质谱信号强度的比值。 6.6.3化合物间浓度差检测 AC 采用紫外分光光度法对互补链退火后形成的磷酸化标记核酸双链进行紫外吸收强度测定，将检测 的质量浓度除以互补链混合产物的相对分子质量得出摩尔浓度，最终计算不同的磷酸化标记核酸双链 间的摩尔浓度差即化合物间浓度差。 6.7脱磷酸化产物检测 采用6.2.2方法测定，计算未标记上磷酸基团的产物峰（其相对分子质量比目标相对分子质量低 79.98）的质谱信号强度占所有质谱峰信号强度的比值，得出脱磷酸率。 GB/T39512—2020 6.8 3连接效率检测 6.8.1样品准备 采用凝胶电泳法测定连接效率，向5μL1mmol/L的磷酸化标记核酸原液中加入6.5μL1mmol/L 的质检底物、2μL10X连接缓冲液和2.5μgT4DNA连接酶，定容至20μL后混匀制备反应液。将配 制的反应液置于20℃下反应4h，反应后取2uL反应液稀释25倍后待用。 6.8.2连接效率检测 反应液进行琼脂糖凝胶电泳；电泳结果采用灰度定量法进行连接效率计算，其中连接效率连接产 物灰度值/（连接产物灰度值十剩余原料灰度值）。 样品保存 贮存于一20℃冰箱，避免反复冻融。未稀释的干粉一20℃保存不宜超过1年；稀释后的样品 20℃不宜超过半年。 8 3报告 磷酸化标记核酸合成后应附合成报告单或等同的指导性文件。文件内容应至少包括以下部分： a) 名称； b）序列； c) 长度； d) 纯化方式； e) 摩尔量； f) 相对分子质量； 浓度； g) h) 保存条件和有效期。 5