ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T39602—2020 牛结节性皮肤病诊断技术 Diagnostic techniques for Lumpy skin disease 2020-12-14实施 2020-12-14发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 39602—2020 目 次 前言 引言 范围 2 规范性引用文件 3 缩略语 临床诊断 4.1 易感动物 4.2 临床症状 4.3 病理变化 4.4 结果判定 5 实验室诊断样品采集 5.1 器材 5.2 试剂 5.3 样品采集 5.4 样品的送检与保存 5.5 样品处理 6电镜观察 6.1 器材 6.2 试剂 6.3 操作步骤 6.4 结果判定 7. 病毒分离与鉴定 7.1 器材 7.2 细胞与试剂 7.3 病毒分离 7.4 病毒鉴定 8 实时荧光聚合酶链式反应（实时荧光PCR） 8.1 器材 8.2 试剂 8.3 引物及探针 8.4 标准毒株和细胞 8.5 样品的处理 8.6 病毒DNA的提取和纯化 8.7 实时荧光PCR检测 8.8 结果判定 9 聚合酶链式反应（普通PCR方法） GB/T39602—2020 9.1 器材 9.2 试剂 9.3 引物 9.4 样本的制备 9.5 PCR检测 9.6 结果判定 10 微量中和试验（VN) 10.1 器材 10.2 细胞株 10.3 标准毒株… 10.4 操作步骤…. 10.5 阴阳性对照 10.6 结果判定 10 10.7 结果解释 10 11 综合判定 10 11.1疑似 10 11.2 确诊 10 附录A（规范性附录） 试剂的配制 11 附录B（资料性附录） 引物扩增序列 GB/T39602—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准对应于OIE最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2018版）的3.4.12牛结节性皮肤 病（LSD)有关内容，且与该条标准的一致性程度为非等效。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国上海 海关、重庆澳龙生物制品有限公司。 本标准主要起草人：聂福平、李林、李应国、吴晓东、王昱、杨俊、樊晓旭、王国民、李贤良、南文龙 史梅梅、张雷、邹艳丽、王志亮、李键、冉智光。 GB/T396022020 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到8.3引物及探针中引物对2和探针2 与《牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法》相 关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人姓名：聂福平、王昱、杨俊、李贤良、王国民、李应国。 地址：重庆市江北区红黄路8号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 IV GB/T39602—2020 牛结节性皮肤病诊断技术 1范围 本标准规定了牛结节性皮肤病（LSD)的临床诊断、实验室诊断技术和程序。 本标准适用于牛结节性皮肤病的诊断。病毒分离与鉴定适用于个体动物移动前的无感染证明或临 床病例确诊；电镜观察适用于临床病例确诊；实时荧光PCR与普通PCR适用于个体动物移动前的无感 床病例、监测感染流行率和免疫效果评估。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变（Cytopathiceffect) DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) EDTA：乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid) GMEM：生长营养需要培养基（Glasgow'sModifiedEagle'sMedium） LSD：牛结节性皮肤病（Lumpyskindisease） LSDV：牛结节性皮肤病病毒（Lumpyskindiseasevirus） LTc:羔羊睾丸细胞（Lambtestiscell) ORF：开放阅读框（Openreadingframe） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline） PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） TCIDso：半数组织培养感染量（Mediantissuecultureinfectivedose） Vero：非洲绿猴肾细胞（Africangreenmonkeykidneycell) VN：病毒中和试验（Virusneutralisationtest) 4临床诊断 4.1易感动物 各种品种的牛，包括黄牛、奶牛、亚洲水牛、瘤牛、耗牛均易感，绵羊、山羊及野生动物长颈鹿、黑斑 羚、长角羚羊可人工感染。 1 GB/T39602—2020 4.2临床症状 4.2.1易感动物体温升高达41℃，持续1周2周；鼻炎、结膜炎和唾液过度分泌；厌食，精神委顿，不 愿行走，泌乳奶牛产奶量显著减少。 梢、口鼻黏膜及尾部尤为突出，结节大小不等，可聚成不规则的肿块，可波及全身皮肤、皮下组织、肌肉 组织。 4.2.3易感动物口腔和消化道黏膜表面形成丘疹；全身体表淋巴结肿大；眼、鼻、口、直肠、乳房和生殖 器黏膜表面形成结节，并迅速溃烂。 4.2.4母牛流产与暂时性不孕：公牛罹患睾丸炎和附睾炎，暂时性或终生不育。 4.3病理变化 4.3.1患病动物皮肤表面可见直径0.5cm~5cm、深度1cm~2cm的皮肤结节，累及所有皮肤层、皮 下组织以及相邻的肌肉，并伴有充血、出血、水肿、血管炎和坏死；口腔、气管、生殖道和消化道黏膜（特别 是皱胃)可能存在结节。 4.3.2皮肤、肌肉等结节附近发生炎症反应，结节下、黏膜下、结缔组织或周围组织有浆液性渗出，皮下 组织水肿；咽、呼吸道、消化道、包皮、阴道、子宫壁的病变也有此特点。 4.3.3咽、舌和会厌以及整个消化道黏膜出现痘样病变。鼻腔、气管和肺等黏膜出现痘样病变；睾丸和 膀胱出现痘样病变 4.3.4结节切面为乳白色或白色，初期可渗出血清，2周内结节内可能出现锥形中央核或坏死组织/坏 死灶。 4.4 结果判定 4.4.1易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判为疑似牛结节性皮肤病。 物的抗凝血、睡液、鼻眼分泌物进行实验室诊断。 5实验室诊断样品采集 5.1器材 5.1.1 手术剪刀和镊子。 5.1.2灭菌样品保存管（15mL或50mL）。 5.1.3离心管（2mL,10mL）。 5.1.410mL~20mL灭菌注射器。 5.1.5防水标签。 5.1.6 医用防护服。 5.1.7 组织匀浆器。 5.1.8 高速组织匀浆机。 5.2试剂 5.2.1（ 0.1mol/LPBS(pH7.4),按照附录A的A.1配制。 5.2.210%甘油-PBS保存液，按照A.2配制。 5.2.3青霉素，终浓度为1000IU/mL。 2