ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 39920—2021 蛙病毒感染检疫技术规范 Quarantine protocolfor infection withRanavirus 2021-04-30发布 2021-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39920—2021 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市水产技术推广站、北京海关 本标准主要起草人：王娜、张曼、徐立蒲、景宏丽、张舟、李霆、张永宁、张利峰、吴绍强、张文、江育林 GB/T 39920—2021 蛙病毒感染检疫技术规范 1范围 本标准给出了两栖类动物蛙病毒感染（infectionwithRanauirus）的临床症状，规定了蛙病毒感染 的病原分离培养、聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测方法 本标准适用于蛙病毒感染的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（deoxyadenosinetriphosphate) dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（deoxythymidinetriphosphate） EB：漠化乙锭（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） EPC：鲤上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprinicell line) HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulinG) MCP：主衣壳蛋白（majorcapsidprotein） OD：光密度（opticaldensity） PBST：含有Tween-20的磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsalineTween-20） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） TMB：3,3',5,5-四甲基联苯胺（3，3，5,5-Tetramethylbenzidine） 1 GB/T39920—2021 4试剂或材料 4.1 水：符合GB/T6682，一级 4.2 蛙病毒参考株：由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供。 4.3 蛙病毒单克隆抗体：由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供 4.4 羊抗蛙病毒血清：由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供。 4.5 酶标兔抗山羊IgG。 4.6 细胞系：EPC。 4.7 TaqDNA聚合酶：5U/uL。-20℃保存。 4.8 3dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，一20℃保存。 4.9 MgCl2:25mmol/L,一20℃保存。 4.10 引物：浓度为10μmol/L。 a) 正向引物 F:5'CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT 3'; b) 反向引物R:5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3'; c） 扩增蛙病毒主衣壳蛋白（MCP)编码基因，预期长度为585bp。 4.11 无水乙醇：分析纯，使用前一20℃预冷。 4.12 琼脂糖：电泳纯。 4.13 封闭液：1%明胶。 4.14 终止液：2mol/L的硫酸。 5 仪器设备 5.1 超净工作台。 5.2 2生化培养箱。 5.3 3倒置显微镜。 5.4 4普通冰箱及超低温冰箱。 5.5 5冷冻离心机。 5.6 高压灭菌锅。 5.7 组织研磨器。 5.8 PCR 仪。 5.9 电泳仪。 5.10 微波炉。 5.11 凝胶成像仪。 5.12 酶标仪。 6 临床症状 皮肤溃疡和/或远端肢体坏死，参见附录A。 2 GB/T39920—2021 7样品 按GB/T18088的规定执行。采集活的两栖类动物。体长小于3cm的，切除头和尾，取余下组织； 体长为3cm～6 cm的，取所有内脏；体长大于6cm的,取肝、肾、脾。 8病毒的分离和检测 8.1病毒分离培养 8.1.1样品处理 用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1：10的比例将其重悬于含有1000IU/mL青霉素和 1000μg/mL链霉素的培养液（见附录B中B.1)中，于15℃下孵育2h~4h或4℃下孵育6h～24h。 7000r/min，4℃离心20min，收集上清液。 8.1.2病毒接种与观察 1：1000三个稀释度的上清液接种到生长约24h的EPC单层细胞上（96孔板中），每个样品至少接种 3孔，每孔接种100μL，置于25℃培养。试验设置3孔阳性对照（接种病毒参考株）和3孔空白对照（未 接种病毒的细胞）。 8.1.2.2逐日用倒置显微镜观察细胞病变效应（CPE)是否出现，连续观察7d。如果7d内接种组织匀 浆上清液的细胞培养物未出现CPE，需盲传一次。盲传时，将接种组织匀浆上清液的细胞培养物冻融 一次后收集，7000r/min，4℃离心20min，收集上清液。将上清液100μL接种到同种长满单层新鲜细 胞的96孔板中，置于25℃培养，再观察7d 8.1.2.3如果空白对照细胞形态正常，阳性对照孔细胞出现CPE，当接种被检匀浆上清稀释液的细胞 或盲传后的细胞出现CPE时，应立即取病毒悬液用PCR或ELISA方法进行病毒的检测。如果仅有阳 性对照出现CPE，样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如果阳性对照未出 现CPE，则试验无效，应重新进行试验。 8.2PCR检测 8.2.1样品处理 如果是组织样品，取50mg～100mg组织。先加150μLCTAB溶液（见B.3），用组织研磨器将 样品匀浆成糊状，放入1.5mL的离心管中，再将CTAB溶液补加至900μL。如果是出现CPE的细胞 悬液，则取450μL细胞悬液加入450μLCTAB溶液混匀。25℃作用2h～2.5h。 8.2.2DNA抽提 在含有样品的离心管中加人600μL抽提液I（见B.4），充分混合不少于30s。12000r/min离心 5min，取上层水相（约800μL），再加入700L抽提液Ⅱ（见B.5），充分混合至少30s。12000r/min 离心5mi，取上层水相（约600），再加入一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900uL），倒置数 次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min，小心弃去上清。干燥后加20μL水 溶解，用作PCR模板。 注：也可使用同等抽提效果的其他方法或使用商品化试剂盒抽提病毒DNA， 3 GB/T39920—2021 8.2.3PCR扩增 在PCR管中加人以下试剂：10×PCR缓冲液（不含Mg²+）10μL、25mmol/L的MgCl²10μL、 增35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。 8.2.4琼脂糖电泳 用1X电泳缓冲液（见B.7)配制1.5%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mLEB，见B.8，或其他经过验证的 等效染色试剂）。将5μL样品和1uL6×上样缓冲液（见B.9)混匀后加入样品孔进行电泳。电泳结束 后，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。 8.2.5设立对照 8.2.5.1实验过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 8.2.5.2取含有已知蛙病毒参考株的细胞悬液或已知感染蛙病毒的组织作为阳性对照 8.2.5.3取正常的细胞悬液或阴性组织作为阴性对照。 8.2.5.4取等体积的水代替模板作为空白对照。 8.2.6结果判定 8.2.6.1 PCR产物电泳后，阳性对照会出现585bp的DNA片段，阴性对照和空白对照均没有该核 酸带。 8.2.6.2待测样品PCR扩增后，在585bp的位置上有条带者，切胶后进行测序。 8.2.6.3将测序获得序列（参见附录C)与已知的蛙病毒MCP基因序列进行比对，如果与其同源性最近 的序列属于蛙病毒属病毒，可判定为蛙病毒阳性；否则，判定为蛙病毒阴性。 8.3ELISA检测 8.3.1试验步骤 8.3.1.1用pH9.6的包被液（见B.10）按说明书稀释纯化的蛙病毒单克隆抗体，包被ELISA板，每孔 100μL，4℃孵育过夜。 8.3.1.2用含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(PBST,见B.12)洗3次。 8.3.1.3用1%明胶（PBST配制）（200μL/孔）封闭，37℃孵育1h，PBST洗3次。 8.3.1.4加人2倍或4倍系列稀释的待测样品或者病毒培养液、蛙病毒参考株（阳性对照）、正常组织样 品（阴性对照）和细胞培养液（空白对照），各加2孔，每孔100μL，37℃孵育1h。PBST洗3次。 8.3.1.5将山羊抗蛙病毒血清用细胞培养液稀释到工作浓度，每孔加100μL，37℃孵育1h。PBST洗 3次。 8.3.1.6加人0.1%HzOz（用双蒸水稀释），每孔150μL，37℃孵育15min，PBST洗2次。 8.3.1.7将辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG（酶标二抗)用细胞培养液稀释到工作浓度，每孔100μL， 37℃孵育1 h。PBST洗3次。 8.3.1.8加人底物（见B.15），每孔100uL，37℃，避光反应10min～30min，当阳性对照出现明显蓝 色，阴性对照无色时加人终止液每孔150μL，用酶标仪测量各孔在450nm波长时的光密度值（OD450 值)。 4 GB/T3