ICS65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 40138—2021 南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Southern bean mosaic virus 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40138—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、广州海关技术中心、福建省农业科学院果树研究所。 本文件主要起草人：张永江、刘晗、冯黎霞、谢丽雪、向均 GB/T40138—2021 南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本文件规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法， 本文件适用于豆科植物植株及种子中南方菜豆花叶病毒的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4南方菜豆花叶病毒分类信息 中文名：南方菜豆花叶病毒 学名：Southernbeanmosaicvirus 异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4；南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirus1； 菜豆南方花叶病毒Beansouthernmosaicvirus 分类地位：类南方菜豆花叶病毒目（Sobelivirales）南方菜豆一品红花叶病毒科（Solemoviridae）南 方菜豆花叶病毒属（Sobemouirus） 南方菜豆花叶病毒的其他信息见附录A。 5 方法原理 南方菜豆花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据南方菜豆花叶病毒 与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DoubleAntibodySandwich EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，DAS-ELISA）；依据南方菜豆花叶病毒的基因组特征建立反转 录重组酶聚合酶扩增技术（ReverseTranscriptionRecombinasePolymeraseAmplification，RT-RPA）和 荧光RT-PCR检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有南方菜豆花叶病毒 6试剂、仪器设备及用具 6.1试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 1 GB/T40138—2021 DAS-ELISA试剂应符合附录B中的B.1； RT-RPA试剂应符合附录C中的C.1; 荧光RT-PCR试剂应符合附录D中的D.1。 6.2 仪器设备 电子天平：感量0.001g。 高速冷冻离心机：最大转速15000r/min。 微型瞬时离心机：最大转速7000r/min。 普通冰箱：4℃。 超低温冰箱：一80℃。 制冰机：每日制冰能力为110kg。 旋涡振荡器：最大转速为2800r/min。 磁力搅拌器：搅拌容量50mL~2000mL。 高压灭菌锅：最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105℃～135℃。 pH计：量程pH0.00~14.00.精度±0.01pH。 紫外可见分光光度计：波长范围为220nm～750nm，波长精度为1nm，分辨率为3nm。 金属浴：温度范围4℃~150℃，控温精度士0.3℃。 荧光PCR仪：温度范围4℃~100℃，温度均一性±0.4℃。 微波炉：烧烤型。 电泳仪：输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA 凝胶成像分析仪：光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、 机载头像捕捉软件、图像分析软件。 洗板机：清洗容量50μL~2000μL。 酶标仪：光源波长：250nm~750nm，温度范围4℃~99℃。 6.3用具 酶联板。 PCR管。 可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）。 可调移液器头。 1.5mL离心管。 研钵、微型磨杆等。 7 样品制备 7.1 植株制样 待测样品为植株小苗时，挑选有疑似症状的部位取样，症状描述信息见附录A；未表现症状的植株 分组（10株为1组）编号，将采集的每组样品分成3份，作为待检样品。 7.2 种子样品直接制样 待检测样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小或有黑斑的种子；未表现症状种子分组（10粒为1组）编 号，研磨成粉末，分成3份；在粉末中加入样品抽提缓冲液（B.1.5），充分浸泡后离心取上清液作为待检 样品。 2 GB/T40138—2021 7.3种子样品种植制样 将种子播种于灭菌土中，待长出3片～4片真叶后进行检测，取样制样同7.1。 8检测鉴定 8.1DAS-ELISA测定 把制备的样品上清液加人已包被南方菜豆花叶病毒抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每 个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染南方菜豆花叶病毒的植物组织作为阳 性对照，样品提取缓冲液作为空白对照：其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品相 一致。 具体操作按照附录B规定的方法进行。 8.2RT-RPA检测 RT-RPA检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddH,O)作为空白对照。分别提取样品和 8.3荧光RT-PCR检测 荧光RT-PCR检测阴性和阳性对照设置同8.1，灭菌双蒸水（ddH,O)作为空白对照。分别提取样 品和对照的总RNA后进行荧光RT-PCR检测，具体操作按照附录D规定的方法进行。 结果判定 9 样品携带南方菜豆花叶病毒。 10结果记录与样品保存 10.1结果记录 联反应数值；RT-RPA检测应有电泳图片；荧光RT-PCR检测应有扩增曲线图。 10.2样品保存 阳性样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于一80℃冰箱，至少保存1年。保存的样品要做好 标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，应经灭活处理。 3 GB/T40138—2021 附录A （资料性） 南方菜豆花叶病毒其他信息 A.1寄主范围 寄主范围窄。除干日红（Gomphrenaglobosa）外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆 （Phaseolusvulgaris）、豇豆（Vignaunguiculata）、黑吉豆（Vignamungo）、绿豆（Vignaradiata）、棉豆 （Phaseolus lunatus）和大豆（Glycine mar）等。 A.2地理分布 中国、印度、伊朗、巴基斯坦、贝宁、科特迪瓦、加纳、摩洛哥、美国、尼日利亚、塞内加尔、多哥、墨西 哥、哥斯达黎加、尼加拉瓜、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉、法国、荷兰、西班牙等地。 A.3症状 菜豆（Phaseolusuulgaris）：B株系和M株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些 不能系统侵染。菜豆上的系统侵染根据寄主的不同变种，其症状有轻重。轻者引起微弱花叶，重者造成 严重花叶甚至新叶畸变。G株系通常诱发无症状表现的系统侵染（见图A.1）。 大豆（Glycinemaa）：许多株系可引起较弱的系统斑驳。 棉豆（Phaseoluslunatus）：B株系诱发产生小坏死斑。其他株系不敏感 绿豆（Vignaradiata）：株系G引起局部小环死斑，有些分离物引起系统花叶。 豇豆（Vignaunguiculata）：株系G在某些过敏品种引起局部枯斑。系统症状表现为明脉、花叶和 畸叶。 图A.1南方菜豆花叶病毒侵染菜豆（左）和大豆（右）引起的症状 A.4传播途径 病毒可由叶甲传播：菜豆种传率为1%~5%，豆种传率为5%～40%；实验中易于机械接种传播， A.5粒体形态 4 GB/T 40138—2021 A.6 抗原特性 南方菜豆花叶病毒抗原性强，容易制备高滴度的特异性抗体 A.7 基因组 基因组为ssRNA，全长约4136nt，编码4个蛋白，分别编码21kDa蛋白、105kDa蛋白（推测为聚 个VPg，可能是侵染所必需的。 5