ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40172—2021 哺乳动物细胞交叉污染 检测方法通用指南 General guidance on detection methods of mammalian cell cross-contamination 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40172—2021 目 次 前言 范围 1 2 规范性引用文件 3 术语和定义 缩略语 5 检测的基本原则 6 检测方法的类别 7 检测方法的选择 8 样品、试剂和仪器· 9 质量控制 10 报告 附录A（资料性） 细胞交叉污染检测方法 附录B（资料性) 细胞交叉污染检测报告参考模板 参考文献 GB/T40172—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：深圳华大生命科学研究院、安徽环球基因科技有限公司、深圳吉诺因生物科技有 限公司、成都柏奥特克生物科技股份有限公司、通用生物系统（安徽）有限公司。 缪连军、黄林、梁智杰、 1 GB/T 40172—2021 哺乳动物细胞交叉污染 检测方法通用指南 1范围 本文件提供了哺乳动物细胞交叉污染检测的基本原则、方法的类别和选择、样品、试剂和仪器等方 面的指导。 本文件适用于哺乳动物细胞（如人源细胞）的交叉污染检测。 本文件不适用于非哺乳动物细胞的交叉污染检测 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 ISCN（2020）人类细胞遗传学国际命名体制（2020版）（AnInternationalSystemforHumanCy togenetic Nomenclature) 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细胞系 cell line 由原代细胞或细胞群经传代培养而获得的具有非均质性特征的细胞群。 ［来源：1SO21427-2:2006,3.1] 3.2 细胞交叉污染 cellcross-contamination 细胞在分离、培养等过程中，与来源于种属内或种属外的非目标细胞之间发生的相互污染。 3.3 种属间细胞交叉污染 inter-species contamination of cells 来源于两种或者两种以上不同种属的细胞发生混合。 3.4 种属内细胞交叉污染 intra-species contamination of cells 来源于同一种属内的同类型细胞（不同个体）或不同类型的细胞（相同或不同个体）发生混合。 3.5 短串联重复序列 short tandem repeat 重复序列为2到13个碱基对，重复次数可以为5次到上百次，且不同的重复序列以相邻形式排列 的基因片段。 ［来源：1SO25720:2009,4.26] 1 GB/T40172—2021 3.6 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。 ［来源：SN/T1195—2003，3.2，有修改］ 3.7 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism 一种发生在基因组特定位置的单个核苷酸A、T、C或G的变异而引起的DNA序列的改变，且在人 群中以明显的频率发生（比如1%），造成的包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。 来源：ISO25720：2009，4.23 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 COl：细胞色素c氧化酶1(cytochromecoxidasesubunit1) CYTB:细胞色素b(cytochromeb) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） FACS：荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activatedcellsorting） G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase） HLA：人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen） LDH；乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase) MEF：小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblasts） MD：苹果酸脱氢酶（malatedehydrogenase) NP：核苷磷酸化酶（nucleosidephosphorylase） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) SNP：单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism） STR：短串联重复序列（shorttandemrepeats） 5检测的基本原则 5.1检测内容 5.1.1为获得准确的检测结果，细胞交叉污染的检测范围宜包括：种属间细胞交叉污染检测、种属内细 胞交叉污染检测和细胞专属特性检测。 5.1.2种属间细胞交叉污染主要是因来源不同种属（两种或以上）的细胞之间发生混合导致，因此根据 种属之间的生物学特征差异进行检测是非常重要的，这些生物学特征一般包括： 生物化学特征（如同工酶、表面抗原）； 细胞遗传学特征（如染色体核型、标记染色体）： 免疫学特征（如组织相容性抗原、特异性免疫血清）。 5.1.3种属内细胞交叉污染主要是由同一种属的不同个体的细胞之间发生混合导致，因此根据不同个 体间的差异特征进行检测是十分重要的，这些生物学特征一般包括： 一形态学特征（如圆形、长梭形、聚团生长等）； 遗传标记（STRSNP）等 2 GB/T40172—2021 特征进行检测。 5.2检测时间 5.2.1对于原代培养的细胞，宜在细胞培养的早期阶段（第一周）就进行细胞交叉污染的检测；哺乳动 物细胞（含人源细胞）在细胞冻存前进行细胞交叉污染检测也是十分重要的。 5.2.2对于需要长期培养或者生长活跃的细胞，定期进行细胞交叉污染检测是至关重要的；在试验或 者生产开始前，通过确认形态特征、培养特性是否与目标细胞一致也是十分必要的。 6检测方法的类别 6.1概述 细胞交叉污染检测常用的方法共有9种，包括细胞形态检测法、同工酶谱检测法、染色体核型检测 法、HLA基因型检测法、PCR检测法、STR基因分型检测法SNP检测法、流式检测法和免疫荧光染色 检测法。细胞交叉污染检测方法的分析见附录A。 6.2细胞形态检测法 6.2.1细胞形态检测法一般通过对细胞生长形态、生长特性等特征进行检测，初步判断是否发生细胞 交叉污染。细胞形态检测法适用于贴壁生长的细胞发生的交叉污染检测，不适用于悬浮生长的细胞， 6.2.2细胞形态检测法的检测指标一般包括细胞形态（如圆形、梭形等）、细胞直径、细胞体积。由于较 低的检测准确性，若通过细胞形态检测法检测出细胞可能出现交叉污染，选择其他的检测方法进一步验 证和确认是十分重要的。 6.3同工酶谱检测法 6.3.1由于不同种属来源的细胞在同工酶谱分布上具有差异，通过凝胶电泳分离后，对电泳带型和相 对迁移距离进行检测，可用于细胞交叉污染的检测。 6.3.2同工酶谱检测法适用于种属间的细胞交叉污染检测。 胞交叉污染 6.3.3采用同工酶谱检测法进行细胞交污染检测时，检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、乳酸脱氢酶 样品存在种属间的细胞交义污染。 6.4染色体核型检测法 6.4.1染色体核型检测法可以根据细胞染色体的形态、结构、数目、长度、着丝点位置、臂比、随体大小 等特征进行细胞交叉污染的检测。 6.4.2染色体核型检测法适用于种属间的细胞交叉污染检测；转化细胞可能出现非整倍体和异倍体， 染色体核型检测法不适用此类型细胞的交叉污染检测。 注：亲缘关系接近的灵长类动物细胞的染色特征比较接近，采用该法进行鉴定需仔细辨别每一谱带的特点。 6.4.3染色体核型检测宜根据《人类细胞遗传学国际命名体制（2020版）》建立的G显带法进行核型检 测和描述。 6.4.4若待检细胞样品的染色体特征（如数量、结构、标记物）与目标细胞核型检测结果不一致，可以判 定该细胞存在种属间细胞交叉污染。 3 GB/T40172—2021 6.5HLA基因型检测法 6.5.1HLA因其高度多态性而成为最能代表个体特异性并伴随个体终身的稳定的遗传标志，在无关 个体之间HLA型别完全相同的几率极低，因此通过检测细胞的HLA基因型可以确定细胞是否存在交 叉污染。 6.5.2由于HLA基因型只存在人体中，HLA基因分型检测法适用于不同人源细胞之间（种属内）的交 叉污染检测。 6.5.3HLA基因型检测法宜采用序列特异性引物进行PCR扩增，并结合第二代测序技术进行HLA 高分辨的分型检测。 6.5.4若待检细胞样品的HLA基因分型结果与目标细胞存在明显差异，可以判定该人源细胞存在种 属内细胞交叉污染。 6.6PCR检测法 6.6.1PCR检测法是基于种属间进化保守性差异建立的细胞交叉污染检测方法，具有较高的灵敏度和 特异性。自前，细胞色素b（cytochromeb，CYTB）和细胞色素c氧化酶1（cytochromecoxidasesubunit 1,CO1)等保守基因在不同种属间具有较大差异，已被用于进行细胞交叉污染的检测。 6.6.2PCR检测法目前主要适用于种属间的细胞交叉污染检测。 6.6.3采用基于CO1的PCR检测法进行种属间细胞交叉污染检测时，检测方法和结果判定参考 ANSI/ATCCASN-00032015。 6.7STR基因分型检测法 多个STR位点获得STR图谱，检测细胞是否存在交叉污染，具有高灵敏度、高鉴别能力和标准化自动 分型等特征。 6.7.2STR基因分型检测法适用于种属内的细胞交叉污染检测。 6.7.3采用STR基因分型检测法进行人源细胞交叉污染检测时，检测的STR位点宜包含：D13S317， TH01,D5S818,D16S53，TPOX,D7S820,CSF1PO，vWA和性别决定位点Amelogenin（AMEL）。 6.7.4采用STR基因分型检测法进行人源细胞系交叉污染（不同个体）时，检测方法和结果判定可参 考ANSI/ATCCASN-0002—2011。 6.8SNP检测法 6.8.1SNP检测法是依据基因组上多个位点的单个核苷酸变异形成的遗传标记，通过对其多个位点的 SNP图谱的进行联合分析，从而可以检测是否存在细胞交叉污染。 6.8.2SNP检测法适用于种属内的细胞交叉污染检测。 6.8.3采用SNP