ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40173—2021 水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法 Determination of reducing-end sugar in water-soluble chitosan- Spectrophotometric method 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40173—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位：青岛科技大学、中国测试技术研究院生物研究所、青岛市计量技术研究院、武汉新 华扬生物股份有限公司、正大投资股份有限公司青岛分公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、深圳市市场 监督管理局许可审查中心。 本文件主要起草人：张永勤、吕兴霜、李怀平、李剑、伍发兴、徐丽、王斐、邵静、张凤国、詹志春、 马丽侠、毕毅奋、周樱、夏春、蒋子敬、许文廷、张菁、邢明霞、王家林、李玉奎 1 GB/T 40173—2021 水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法 1范围 本文件规定了水溶性壳聚糖中还原性端基糖的分光光度测定方法。 本文件适用于水溶性壳聚糖（含量90%，脱乙酰度≥90%）中还原性端基糖的检测 本方法检出限为0.006mmol/g，定量限为0.023mmol/g。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 3.1 壳聚糖chitosan 甲壳素脱乙酰基后得到的衍生物，不溶于水，溶于大多数稀酸，化学名称为β-1，4-2-氨基-2-脱氧-D 葡聚糖。 3.2 脱乙酰度degreeof deacetylation 壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数。 3.3 水溶性壳聚糖 water-solublechitosan 可溶于酸性、中性和碱性溶液的低聚合度壳聚糖。 4原理 壳聚糖分子末端的还原性端基糖在碱性条件下与3-甲基-2-苯并噻唑酮踪（MBTH）反应生成吖嗪： 酸性条件下过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与吖嗪反应生成青蓝色化合物，还原端基糖的浓度 在一定范围内与其在590nm处的吸光度呈正比例线性关系。通过测定在590nm处的吸光度值，外标 法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为符合GB/T6682规定的三级水 5.13-甲基-2-苯并噻唑啉酮粽盐酸盐一水合物（MBTH,CH,N,S·HCIHzO)：CAS号：38894-11-0， 1 GB/T40173—2021 纯度≥98%。 5.3盐酸氨基葡萄糖标准品（C，Hi3NO，·HCI)：CAS号：66-84-2，纯度≥99%，或经国家认证并授予 标准物质证书的标准物质。 5.4浓盐酸。 5.5氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：称取2g氢氧化钠，加水溶解，用水稀释并定容至100mL，混匀。 5.6MBTH溶液：称取0.3gMBTH，加水溶解，用水稀释并定容至100mL，混匀，于4℃避光贮存，有 效期10天。 5.7DTT溶液：称取0.080gDTT，加水溶解，用水稀释并定容至100mL，混匀，于4℃避光贮存，有效 期10天。 5.8MBTH试剂：将MBTH溶液（5.6）和DTT溶液（5.7）等体积混合，即得MBTH试剂。临用新配。 5.9硫酸铁铵试剂：称取5g硫酸铁铵[NH,Fe（SO,）²·12HO]和5g氨基磺酸，加人41.8mL浓盐 酸，待充分溶解至澄清，用水稀释并定容至1000mL，混匀，于4℃避光保存，有效期1个月。 5.10盐酸氨基葡萄糖标准溶液（0.1mg/mL）：称取0.1g盐酸氨基葡萄糖（精确至0.0001g），加水溶 解，用水稀释并定容至100mL，混匀，（浓度为1mg/mL）；准确吸取上述溶液10mL，用水稀释定容至 100mL，混匀，临用新配。 6仪器设备 6.1分析天平：感量为0.01g和0.0001g。 6.2恒温振荡水浴锅：温控精度土0.2℃。 6.3涡旋振荡器。 6.4分光光度计：配1cm比色皿。 7试样溶液的制备 7.1试样制备 准确称取试样约0.1g（精确至0.0001g），加水约50mL，涡旋混勾使其溶解，加水定容至100mL， 静置，取上清液作为试样溶液。 7.2标准工作溶液的配制 10mL,配成浓度为0mg/mL.0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL.0.07mg/mL0.09mg/mL的 标准工作溶液。 8测定步骤 8.1标准曲线的制作 分别移取盐酸氨基葡萄糖标准工作溶液500uL，各加入500uL0.5mol/L氢氧化钠溶液和500μL MBTH试剂于比色管中，混匀，于80℃水浴13min，趁热迅速加人1000μL硫酸铁铵试剂，混匀，放置 显色1h。以水调节零点，于波长590nm处测定吸光度值。以盐酸氨基葡萄糖的质量浓度为横坐标， 标准工作溶液吸光度值与质量浓度为零的空白管的吸光度的差值为纵坐标绘制标准曲线。 2 GB/T 40173—2021 8.2 试样溶液的测定 移取试样溶液500μL，加入500uL0.5mol/L氢氧化钠溶液和500μLMBTH试剂于试管中，混 匀，于80℃水浴13min，趁热迅速加入1000L硫酸铁铵试剂，混匀，放置显色1h。以水调节零点，于 波长590nm处测定吸光度值。将待测样吸光度值与质量浓度为零的空白管的吸光度值差值代人标准 曲线，计算试样中还原端基糖的含量。 9 结果计算与表示 9.1结果计算 试样中还原端基糖含量按式（1）计算。 Aε-Ab-Co X X1000 .(1) k×mxM 式中： X 试样中还原端基糖的含量，单位为毫摩尔每克（mmol/g）； Ae 待测样的吸光度值； Ab 空白管的吸光度值； Co 标准曲线的截距； k 标准曲线的斜率，单位为毫升每毫克（mL/mg）； m 水溶性壳聚糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； M 盐酸氨基葡萄糖的分子质量，215.63g/mol。 9.2 结果表示 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 GB/T 40173—2021 8.2 试样溶液的测定 移取试样溶液500μL，加入500uL0.5mol/L氢氧化钠溶液和500μLMBTH试剂于试管中，混 匀，于80℃水浴13min，趁热迅速加入1000L硫酸铁铵试剂，混匀，放置显色1h。以水调节零点，于 波长590nm处测定吸光度值。将待测样吸光度值与质量浓度为零的空白管的吸光度值差值代人标准 曲线，计算试样中还原端基糖的含量。 9 结果计算与表示 9.1结果计算 试样中还原端基糖含量按式（1）计算。 Aε-Ab-Co X X1000 .(1) k×mxM 式中： X 试样中还原端基糖的含量，单位为毫摩尔每克（mmol/g）； Ae 待测样的吸光度值； Ab 空白管的吸光度值； Co 标准曲线的截距； k 标准曲线的斜率，单位为毫升每毫克（mL/mg）； m 水溶性壳聚糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； M 盐酸氨基葡萄糖的分子质量，215.63g/mol。 9.2 结果表示 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 GB/T 40173—2021 8.2 试样溶液的测定 移取试样溶液500μL，加入500uL0.5mol/L氢氧化钠溶液和500μLMBTH试剂于试管中，混 匀，于80℃水浴13min，趁热迅速加入1000L硫酸铁铵试剂，混匀，放置显色1h。以水调节零点，于 波长590nm处测定吸光度值。将待测样吸光度值与质量浓度为零的空白管的吸光度值差值代人标准 曲线，计算试样中还原端基糖的含量。 9 结果计算与表示 9.1结果计算 试样中还原端基糖含量按式（1）计算。 Aε-Ab-Co X X1000 .(1) k×mxM 式中： X 试样中还原端基糖的含量，单位为毫摩尔每克（mmol/g）； Ae 待测样的吸光度值； Ab 空白管的吸光度值； Co 标准曲线的截距； k 标准曲线的斜率，单位为毫升每毫克（mL/mg）； m 水溶性壳聚糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； M 盐酸氨基葡萄糖的分子质量，215.63g/mol。 9.2 结果表示 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。