ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 40183—2021 DNA甲基化的测定 焦磷酸测序法 Determination of DNA methylationPyrosequencing 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40183—2021 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发 育生物学研究所农业资源研究中心、河北师范大学。 本标准主要起草人：吕品、马爱进、张岩、林浩、李永鹏、李东明、黄芸、杨宏超。 GB/T 40183—2021 DNA甲基化的测定 焦磷酸测序法 1范围 本标准规定了用焦磷酸测序法测定DNA甲基化的方法。 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞DNA甲基化测定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 DNA甲基化 DNAmethylation 在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的 过程。 3.2缩略语 SAC 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 4 原理 DNA经重硫酸盐硫化处理后,DNA双链中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，通过PCR将尿嘧啶 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1水：GB/T6682,二级水。 5.2 动物基因组DNA提取试剂盒 5.3 植物基因组DNA提取试剂盒。 5.4 20pmol/μL焦磷酸测序用引物。 5.5 PCR试剂盒。 1 GB/T40183—2021 5.6 DNA重亚硫酸盐快速转化试剂盒， 5.7焦磷酸测序试剂盒。 5.870%（体积分数）乙醇。取70mL无水乙醇加水稀释定容至100mL 5.9溴化乙锭溶液。称取1g溴化乙锭加水稀释定容至100mL，磁力搅拌至完全溶解，然后将溶液保 存于棕色瓶中，室温保存。 0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液（pH8.0），再加蒸馏水定容至1000mL，室温保存，稀释50倍使用 5.112%（质量分数）琼脂糖凝胶。称取2g琼脂糖置于烧瓶中，加入100mL电泳缓冲液，加热使琼脂 糖充分溶解，适当冷却，然后加入7uL溴化乙锭溶液，混匀，将其缓慢地倒人放有梳子的制胶槽中，室温 放置待琼脂糖凝固后拔下梳子，取出凝胶，4℃密封保存备用。 5.126X电泳加样缓冲液。称取0.25g溴酚蓝、40g蔗糖置于100mL烧杯中，加蒸馏水至完全溶解 后定容至100mL。 5.130.5mol/L乙二胺四乙酸溶液。称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加人80mL水，充分 搅拌，用氢氧化钠调pH至8.0，然后定容至100mL。 5.14标准相对分子质量DNA（100bp~2000bp）。 6仪器设备 6.1 分析天平：感量0.001g。 6.2离心管：1.5mL和2mL。 6.3 PCR 仪。 6.4水平电泳槽。 6.5电泳仪。 6.6低温离心机：最大离心力25910g。 6.7凝胶成像系统。 6.8核酸检测仪。 6.9焦磷酸测序仪。 6.10 PCR管。 7测定步骤 7.11 DNA提取 按照动物或植物基因组DNA提取试剂盒说明进行提取。 7.2 2DNA重亚硫酸盐转化 按照DNA重亚硫酸盐快速转化试剂盒说明进行操作。 7.3甲基化PCR扩增目的片段 7.3.1PCR反应体系 配制50μLPCR反应体系：以10ng～20ng重亚硫酸盐转化后的DNA溶液为模板，按照PCR试 剂盒说明加人试剂，再加入焦磷酸测序引物对中的上下游引物各0.5uL，用水补足体积至50μL。在 PCR仪上扩增。 2 GB/T 40183—2021 7.3.2PCR扩增产物电泳检测 示剂迁移至凝胶中部；用凝胶成像系统观察电泳结果并记录；电泳检测合格的PCR产物用于测序 7.4焦磷酸测序 利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作：在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序 PCR产物和3μuL焦磷酸测序测序仪配套的磁珠，运行焦磷酸测序仪程序，导出结果。 3结果分析 8 使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷贝到电脑中，打开软件并载人运行后的文件，选择CpG模式， 对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析，结果中所测位点处显示的百分数即为该位点甲基化的比例。 SZG GB/T 40183—2021 7.3.2PCR扩增产物电泳检测 示剂迁移至凝胶中部；用凝胶成像系统观察电泳结果并记录；电泳检测合格的PCR产物用于测序 7.4焦磷酸测序 利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作：在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序 PCR产物和3μuL焦磷酸测序测序仪配套的磁珠，运行焦磷酸测序仪程序，导出结果。 3结果分析 8 使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷贝到电脑中，打开软件并载人运行后的文件，选择CpG模式， 对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析，结果中所测位点处显示的百分数即为该位点甲基化的比例。 SZG GB/T 40183—2021 7.3.2PCR扩增产物电泳检测 示剂迁移至凝胶中部；用凝胶成像系统观察电泳结果并记录；电泳检测合格的PCR产物用于测序 7.4焦磷酸测序 利用焦磷酸测序仪及焦磷酸测序试剂盒进行以下操作：在焦磷酸测序仪配套软件中生成运行程序 PCR产物和3μuL焦磷酸测序测序仪配套的磁珠，运行焦磷酸测序仪程序，导出结果。 3结果分析 8 使用焦磷酸测序仪将运行后的数据拷贝到电脑中，打开软件并载人运行后的文件，选择CpG模式， 对每个样本的焦磷酸测序结果进行分析，结果中所测位点处显示的百分数即为该位点甲基化的比例。 SZG