ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40225—2021 肌动蛋白抗体的检测 免疫印迹法 Determination of actin antibody-Western blotting method 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40225—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院、成都正能生物技术有限责任公司、深圳市第二人民医院 甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、上海市计量测试技术研 究院。 本文件主要起草人：李怀平、周李华、邱俊康、马丽侠、顾大勇、张秦川、张译文、蒋子敬、王伟、叶德萍、 何海宁、洪霞、刘刚。 1 GB/T40225—2021 肌动蛋白抗体的检测 免疫印迹法 1范围 本文件描述了肌动蛋白抗体的免疫印迹检测方法 本文件适用于基于免疫印迹法原理的肌动蛋白抗体的测定 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肌动蛋白 actin 类形成微丝的球状多功能蛋白质，细胞骨架的主要成分，广泛表达于真核细胞中。 注1：目前发现肌动蛋白至少存在6种异构体形式，主要分布在心肌、骨骼横纹肌和平滑肌组织中，调控细胞的收缩 能力，也表达于非肌肉细胞，调节细胞结构和活力。 注2：肌动蛋白分子质量为45ku士3ku(1u~1Da），具有高度保守性，在细胞中的表达相对稳定，因此它常被用作 校正系统的内参。 3.2 肌动蛋白抗体 actin antibody 以肌动蛋白为抗原，免疫动物之后获得的动物血清中能够与肌动蛋白特异性“抗原-抗体结合”的免 疫球蛋白的总称。 4 缩略语 SAG 下列缩略语适用于本文件。 APS：过硫酸铵（ammoniumperoxodisulphate) BCA：二喹嘛甲酸（bicinchoninicacid） ECL：化学发光试剂（electrogeneratedchemiluminescence） HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase) NP-40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP40） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline） PBST：磷酸盐吐温缓冲液（phosphatebuffersalinewithTween） PMSF：苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonylfluoride） PVDF：聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride） 1 GB/T40225—2021 SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate) TBS:Tris缓冲盐溶液(tris-bufferedsaline) TBST:Tris缓冲盐吐温溶液（tris-buffered salinewithTween） TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) 5原理 免疫印迹法，又称蛋白质印迹。其基本原理是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区分待测样品不同的 组分，再在电流的作用下，使蛋白质从凝胶转移至固相载体（膜）上，通过特异性抗体作为探针，对靶抗原 蛋白质进行检测，通过分析特异性反应的位置和强度获得特定蛋白质在所分析的细胞或（和）组织中表 达情况的信息。免疫印迹试验通常由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的印迹和检测两个部分组成。 6试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂或生化试剂，试验用水为GB/T6682规定的一级水。 6.1硝酸纤维膜或PVDF膜。 6.2肌动蛋白一抗抗体：betaactin单抗。 6.3HRP标记二抗抗体：HRP标记的羊抗鼠IgG或HRP标记的羊抗兔IgG。 6.4NP-40裂解液。 6.5 PMSF。 6.6 6BCA蛋白测定试剂盒。 6.7 7ECL发光液。 6.8 3TEMED。 6.9 甲醇。 6.10 Tween-20. 6.11 β-巯基乙醇。 6.12 聚丙烯酰胺凝胶储液：30%丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺凝胶储液，按照A.1配制。 6.13 浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris·HCl,pH=6.8），按照A.2配制。 6.14 分离胶缓冲液（1.5mol/LTris·HCl,pH=8.8）按照A.3配制。 6.15 上样缓冲液，按照A.4配制。 6.16 10X电泳缓冲液，按照A.5配制。 6.17 10X转移缓冲液，按照A.6配制。 6.18 1X电泳缓冲液，按照A.7配制 6.19 1X转移缓冲液，按照A.8配制。 6.20 10XPBS缓冲液（0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4)，按照A.9配制。 6.21 1XPBS缓冲液（0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4)，按照A.10配制。 6.22 10XTBS缓冲液（0.1mol/LTris盐缓冲液，pH=7.4），按照A.11配制。 6.23 1XTBS缓冲液（0.01mol/LTris盐缓冲液，pH=7.4），按照A.12配制。 6.24 洗膜缓冲液，按照A.13配制。 6.25 封闭缓冲液，按照A.14配制。 6.26 5%浓缩胶，按照A.15配制。 6.27 12%分离胶，按照A16配制。 6.28 丽春红染色液 2 GB/T40225—2021 6.29显影液。 6.30定影液。 6.31电泳蛋白Marker:10ku~170ku。 7仪器设备 7.1垂直凝胶系统。 7.2 二氧化碳培养箱，37℃土0.5℃。 7.3 电泳仪：恒压不低于220V，恒流不低于400mA。推荐使用带有计时器的电源， 7.4 转移系统。 7.5 化学发光仪 7.6 电子天平，感量为0.1mg。 7.7 离心机：适用15mL离心管，转速不低于10000r/min。 7.8 旋涡振荡器 7.9 9pH计，精度为0.01。 7.10 移液器。 8样品 8.1自制的肌动蛋白抗体建议按照预估效价调整适当稀释梯度进行预试验。 8.2肌动蛋白抗体产品，首次使用时可按照产品说明书进行稀释或选择适当稀释梯度进行预试验，待 确定待测样稀释比例后，后续可沿用合适的固定稀释比例。 9测定步骤 9.1一般原则 9.1.1抗原可采用不同来源的细胞制备，如HeLa细胞、293T细胞等 9.1.2抗体稀释比例和抗原上样量可根据实际试验情况和肌动蛋白抗体效价进行适当调整 9.2抗原的制备 9.2.1当经过处理后的细胞到达处理时间或者细胞密度达到80%～95%时，收集细胞。从二氧化碳培 养箱中取出细胞培养瓶，置于冰上，用移液器吸出培养液。在培养瓶中加入4℃冰箱预冷30min后的 涤后用移液器尽可能吸干残留的缓冲液，以洗去瓶中残留的培养基。注意全程在冰上操作。 冰上裂解20min。然后用细胞刮子沿着瓶壁刮细胞。吸出刮好的细胞裂解液置于15mL离心管中（置 于冰上）。 9.2.3重复步骤9.2.2，尽可能将多的细胞裂解液收集到15mL的离心管中，插入冰盒进行超声，超声 强度以不产生泡沫为准，超声每次2s～3s，重复3次。如仍有细胞碎片或沉淀，宜4℃，10000r/min， 离心10min，取上清。 9.2.4取出少量细胞裂解液测定蛋白浓度（可用BCA蛋白测定试剂盒测定），其余细胞裂解液可分装 保存在一70℃以下备用。 3 GB/T40225—2021 9.3抗原内参储备液的制备 抗原内参储备液母液制备：称取肌动蛋白粉末1mg（精确至0.1mg），加入1mL蒸馏水溶解，使母 液浓度为1mg/mL。 9.4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 9.4.1检查配胶装置，安装制胶配件，制胶灌胶（可使用商品化预制胶），组装电泳槽，注人电泳缓冲液。 9.4.2关于分离胶浓度选择：按照目标蛋白分子质量范围选择待配制分离胶的浓度，见表1。肌动蛋白 分子质量为45ku王3ku，可选择8%～12%浓度的分离胶，本文件给出了12%分离胶的配制，见A.16 表1目标蛋白分子质量与分离胶浓度关系表 分离胶浓度T/% 蛋白质分子质量范围/ku 8 25~200 10 15~100 12 10~70 15 12~45 20 4~40 注：来源参考：Abcam? 9.4.3抗原上样前需与2×上样缓冲液等体积混勾，95℃变性5min。用2×上样缓冲液稀释抗原内参 至10ng/μL,95℃变性5min。变性后的抗原和抗原内参按照规定上样量上样。抗原可参考5μg 10μg、20ug、40ug、60ug总蛋白/泳道的上样量进行上样，抗原内参可参考50ng/泳道进行上样。建 议在邻近的齿孔加人5μL电泳蛋白Marker。 9.4.4将电泳槽连接电源进行电泳，注意正负极的区分。电压调至80V~120V，分离胶电泳时间为 1h2h或直至溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳。 9.5印迹培养 9.5.1电泳结束后比照Marker的大小，选择包含抗原内参凝胶部分，轻轻切下后将凝胶取出，放置于 4℃冰箱预冷30min的1X转移缓冲液中。 9.5.2按照即将切下的目的胶块的大小来剪相应大小的硝酸纤维膜或PVDF膜，剪下后在左上角剪小 角以区分正反面，后将其浸泡于甲醇中活化约1min；之后取出放到配制好的1X转移缓冲液中平衡超 过 5 min。 置1块海绵、3层～5层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡后，放上已平衡好的硝酸纤维膜或PVDF膜，注意 不要有气泡，再放切好的凝胶，3层～5层滤纸、1块海绵。最后合上转膜夹，将其放置于转膜槽中。 9.5.4转膜槽中倒入4℃冰箱预冷30min的1×转膜液，加入冰块，盖上转膜盖。然后将转膜槽放置 于泡沫箱中，加人冰水混合物，以防止转膜过程中产生的热量。检查电极方向并连接电线。在180mA 恒流（或90V恒压）条件下，转移时间为1.5h。 9.5.5转膜结束后，确认Marker是否转移成功。将硝酸纤维素膜或PVDF膜浸没在丽春红染色液中， 摇动5min～10min或更长时间；取出印迹膜，用蒸馏水或1×PBS当溶液漂洗2次～3次，可出现清晰 条带，记录结果。弃去凝胶。 4 GB/T40225—2021 9.6免疫反应 9.6.1封闭 将印迹膜轻轻取出后，放置于封闭缓冲液中，室温条件下摇床2h或者置于4℃冰箱中封闭8h～ 12 h。 9.6.2孵育一抗 将待测样品抗肌动蛋白抗体与封