ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35906—2018 猪瘟抗体间接ELISA检测方法 Indirect ELISA to detect antibody against classical swine fever virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35906—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：王琴、徐璐、范学政、赵启祖、邹兴启、朱元源、宁宜宝 1 GB/T359062018 引言 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒在牛的感染比较严重，偶尔也有猪自然感染的报道。在田间，牛病毒性 腹泻/粘膜病病毒通常对出生后的猪无致病性，仅对胎猪有致病性。虽然牛病毒性腹泻/粘膜病病毒可 在猪群中传播，但这种传播是很有限的。在没有新的传染源引入的前提下，猪群中已经存在的牛病毒性 腹泻/粘膜病病毒会被逐渐清除，病毒的传染链会终止。牛源牛病毒性腹泻/粘膜病病毒是猪感染牛病 毒性腹泻/粘膜病病毒的主要来源，主要与牛猪混养程度或使用了污染牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的牛 源材料有关。在我国生猪饲养的主力主要为大中型养殖场，很少存在猪牛混养情况，因此不会导致牛病 病毒性腹泻/粘膜病病毒等外源病毒检测，因此，疫苗生产工艺的提高也彻底切断了牛病毒性腹泻/粘膜 病病毒在猪群中传播途径。最后，猪瘟疫苗在我国的免疫率接近100%。而猪瘟病毒与牛病毒性腹泻/ 粘膜病病毒为同属病毒，免疫上存在一定的交叉保护。猪群中存在牛病毒性腹泻/粘膜病抗体阳性的可 能性微乎其微。因此，本标准主要针对猪群中猪瘟疫苗免疫后的抗体检测，不用于对个体进行猪瘟抗体 和牛病毒性腹泻/粘膜病抗体的鉴别检测 Ⅱ GB/T 35906—2018 猪瘟抗体间接ELISA检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟抗体的间接ELISA检测方法。 本标准适用于猪瘟抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡标注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽医实验室生物安全技术管理规范（中华人民共和国农业部公告第302号） 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSFV：猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus) ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay） HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase) OD:光密度（OpticalDensity) 4试剂 4.1 猪瘟病毒E2蛋白：见附录A。 4.2 标准阳性血清：猪瘟疫苗免疫仔猪制备，荧光抗体病毒中和试验检测中和抗体效价≥1：20480。 4.3 标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，荧光抗体病毒中和试验病毒抗体检测为 阴性。 4.4 酶结合物：商品化的HRP标记的抗猪IgG抗体，工作浓度参照产品说明书。 4.5 包被液：见附录B中的B.1。 4.6 磷酸盐缓冲液：见B.2。 4.7 封闭液：见B.3。 4.8 1×洗涤液：见B.4。 4.9 稀释液：见B.5。 4.10 底物液A：见B.6。 4.11 底物液B：见B.7。 4.12 终止液：见B.8。 4.13 商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。 1 GB/T35906—2018 5器材和设备 5.137℃温箱。 5.2酶标仪。 5.3各种规格的微量移液器（20μL、200μL、1000μL）和吸头。 5.4多道移液器（200μL)。 5.5酶联反应板。 5.6血清稀释板：96孔一次性U型血凝板或96孔细胞培养板。 5.7 一次性注射器（5mL~10mL）。 6血清样本的采集及处理 6.1样本采集及处理 采集静脉血时，每头猪使用一个注射器。建议进行前腔静脉或耳静脉无菌采血，不少于2mL。室 温静置于斜面2h，待血液自然凝固后，置2℃～8℃冰箱中放置不少于2h，4000r/min离心10min 用移液器小心吸出上层血清。 6.2血清样本的存放与运送 血清样本若在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存。若超过一周检测，应置一20℃以下冷冻 保存。运输时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输 时间应尽量缩短。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7操作步骤 2℃～8℃包被16h。包被结束后，弃去孔中液体，每孔加入1X洗涤液300μL，洗涤1次。 7.2封闭：每孔加入新鲜配制的封闭液300μL，2℃～8℃封闭24h。封闭结束后，弃去孔中液体，每 孔加入1×洗液300L，洗涤1次，即为抗原包被板。抗原包被板若不及时使用，则可将孔中液体在吸 水材料上拍干.于室温中干燥（温度25℃土2℃，湿度≤40%）1h。装于铝箔袋中，抽真空，置于2℃~ 8℃保存备用。 7.3加稀释液：进行血清检测时，向抗原包被板中加人稀释液，50uL/孔。 7.4血清的稀释和加样：将待检血清、标准阴性、阳性对照血清于血清稀释板中分别作1：50稀释后， 按位序分别向抗原包被板中加入稀释后的样本，50L/孔，其中标准阴、阳性对照血清各加2孔。充分 混匀后，37℃温箱中反应30min。吸取不同血清时需要更换吸头。 7.5洗涤：弃去孔中液体，每孔加人300uL洗涤液，室温放置3min，洗涤3次，甩干洗涤液。 7.6加酶结合物和孵育：用稀释液将酶结合物稀释至工作浓度，向每反应孔加入100uL。37℃温箱孵 育30min。 7.7洗涤：同7.5。 7.8加底物和显色：将底物液A和底物液B等体积混合，混合后立即加人到抗原包被板中，每孔 100μL，室温避光显色10min，每孔加人100μL终止液（见B.8）。 7.9每孔加人终止液100μL。 2 GB/T35906—2018 长，以去除背景值，15min内完成。样本OD值=OD450mm一OD20mm/650mm。 7.11结果计算： 阴性对照平均值见式（1)： .(1) 2. 式中： N 阴性对照孔平均值； Ni-—阴性对照孔1的OD值； N2—阴性对照孔2的OD值。 阳性对照平均值见式（2)： (Pi+P2) P ...(2) 2 式中： P 阳性对照孔平均值； P1———阳性对照孔1的OD值； P，一一阳性对照孔2的OD值。 阳性率见式(3)： S IE= X100% .(3 ) P 式中： IE——阳性率; S—样本OD值； P——阳性对照孔平均值。 验成立。否则，应重新检测。 判为猪瘟抗体阴性；当血清样本的IE值在8%～10%之间时，判为可疑。可疑结果可在数日后重新采 样检测。如仍在此范围，判为阴性。 7.14采用商品化试剂盒时，按其说明书进行操作和判定。 3 GB/T35906—2018 附录A （规范性附录） 猪瘟病毒E2蛋白的表达及纯化 A.1材料和试剂 猪瘟兔化弱毒疫苗株；大肠杆菌感受态细胞、pFastBacl质粒、DH1oBac感受态细胞，Sf9细胞、质 粒提取试剂盒、转染试剂、无血清培养基均为商品化试剂。 A,2引物序列 P1-1: 5'>ATAGGATCCACCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAG<3 P2-1: 5TAAGCTTACTTGGTACCGTGATGGTGATGGTGATGTCCCATACCAGCGGCG AGTTGTTCTGTTAGAACTACGTAGGTCACTATCAGC<3 M13F: 5>GTTTTCCCAGTCACGAC<3 M13R: 5>CAGGAAACAGCTATGAC<3 A.3方法 A.3.1重组转移载体的构建 猪瘟兔化弱毒疫苗株RNA的提取、反转录合成病毒cDNA。再用引物P1-1和P2-1扩增猪瘟免化 弱毒疫苗株基因，琼脂糖凝胶纯化，将纯化产物和载体pFastBacl分别用BamHI/HindIII酶切、连接， 转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得的重组转移载体。 A.3.2重组杆粒的构建 将重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞，在筛选培养基上进行蓝白斑筛选，取白斑培养，用 PCR方法进行鉴定，引物为M13F/M13R，目的片段长度为3500bp A.3.3转染及病毒鉴定 将鉴定正确的克隆菌在培养基中扩大培养，用质粒提取试剂盒提取重组杆粒DNA，用转染试剂转 染Sf9细胞，转染后28℃培养96h，获得重组病毒。将病毒液在Sf9细胞上传3代后，以1%的比例感 染Sf9细胞，28℃培养96h后，收集培养上清。 A.3.4猪瘟病毒E2蛋白的纯化 将收集的培养上清12000r/m离心10min，除去细胞碎片，然后将上清用离心超滤法浓缩；浓缩的 上清在镍离子亲和层析洗液（50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠，pH7.0)中4℃透析过夜。平衡 过的上清加入洗液平衡过镍离子亲和层析柱，4℃吸附30min后，用40mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱 液。用SDS-PAGE电泳检测纯化效果。 A.3.5蛋白浓度测定 用BCA法测定蛋白浓度，按说明书配制BSA蛋白标准250ug/mL、125μg/mL、50μg/mL、 4