ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36851—2018 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas vesicatoria 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36851—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国绥芬河出入境检验检疫局、中华人民 共和国甘肃出人境检验检疫局、中国农科院生物技术研究所，中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：田茜、张箭、尤波、王溪桥、赵文军、李为民、历艳 GB/T 36851—2018 辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了辣椒细菌性斑点病菌的样品制备、分离培养及分子生物学等检测方法。 本标准适用于可能携带辣椒细菌性斑点病菌的辣椒植株及种子等样品的检疫鉴定。 2辣椒细菌性斑点病菌基本信息 中文名：辣椒细菌性斑点病菌 学名:Xanthomonas vesicatoria (e.g.Doidge 1920)Vauterin et al. (1995) 异名:Xanthomonas campestris pv.vesicatoria (Doidge)Dye, Bacterium eritiosum Gardner & Kendrick 1921,Bacterium vesicatoria Doidge1920,BacteriumvesicatoriumDoidge1920,Phytomonas eritiosa (Gardner &. Kendrick)Bergey et al.1923,Phytomonas vesicatoria (D.)Stevens 1925,Phyto monas vesicatoria (Doidge)Bergey et al.1930,Pkytomonas eitiosum (G.&.K.)Bergey et al.1923, Pseudomonas eritiosa Gardner & Kendrick 192l,Pseudomonas eritiosum (G. & K.) 192l, Pseudomonas gardneri Sutic 1957,Pseudomonas gardneri var.capsici Sutic 1957,Pseudomonas vesi- catoria (Doidge)Stevens 1925,Xanthomonas aronopodis pv.vesicatoria ,Xanthomonas aronopodis pv. vesicatoria (Doidge)Vauterin et al.,1995,Xanthomonas vesicatoria (D.)Dowson 英文名：Bacterial leaf spot of pepper 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria），黄 单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）。 传播途径：辣椒细菌性斑点病菌主要通过带菌种子进行远距离传播，亦随受侵染的植物残体及茎杆 等传播。在温室，带菌种子是唯一重要的初侵染源，但幼苗移栽也是重要的传播途径。近距离传播主要 借由雨水飞溅或喷洒灌溉传播。 辣椒细菌性斑点病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据辣椒细菌性斑点病在寄主植物上的症状进行初步判定；根据辣椒细菌性斑点病菌的特异性 DNA序列进行分子生物学检测；根据辣椒细菌性斑点病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症 状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备及用具 PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机，台式 小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统等。 4.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。选择性培养基配制方法见附录B；分子生物学检测所需试剂 1 GB/T36851—2018 见附录C和附录D。 5检疫鉴定方法 5.1症状检查 参照附录A中的症状描，重点检查植株的叶片及果实等部位是否具有辣椒细菌性斑点病的疑似症 状。病害的典型症状是：番茄果实表面产生软塞状斑点或疮痴，边缘水渍状，卵形或不规则，辣椒果实 上很少产生症状，但早期感染可引起落果；番茄和辣椒叶片上，病痕出现不规则水渍状，初为绿色，后逐 渐变成褐色并坏死，详见附录A病害症状描述。注意与番茄叶斑病菌（Pseudomonassyringaepv.to- mato)引起的症状区别,后者引起的斑点明显小,并且病斑后期有明显的黄色晕圈 田间无症状植株可随机采样， 5.2样品制备 5.2.1植株样品 对于有症状样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜组织 （叶片或果实）上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氯1%的次 氯酸钠溶液中表面消毒50s～60s，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加5滴~10滴无菌 水，用灭菌镊子或剪刀将病组织捣碎，静置5min～10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生 物学检测。 5.2.2种子样品 对于种子样品，取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）倒人无菌的三角瓶或其他容器内， 加入适量0.05mol/L磷酸吐温缓冲液，使种子完全浸没，轻轻摇晃20s～30s混匀，在4℃下浸泡过 夜。将浸泡液1000r/min离心1min，去沉淀，上清液10000r/min离心10min，弃上清液，取沉淀，用 无菌水悬浮，制成1mL2mL样品悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测。 5.3分子生物学检测 5.3.1模板制备 对于植株或种子样品，按照5.2的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取 试剂盒，按照操作说明提取样品总DNA，一20℃保存备用。 对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000r/min离心 10min，取上清液，一20℃保存）作为分子生物学检测的DNA模板 根据实验室条件，可选择下列任一方法（5.3.2或5.3.3）进行检测 5.3.2PCR凝胶电泳检测 对于种子、植株等样品，以已知带菌的辣椒种子或植物组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模 拟带菌方式代替），以健康的辣椒种子或植物组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测 样品进行PCR凝胶电泳检测。 对于纯培养菌株，以X.vesicatoria标准菌株作阳性对照，用非X，vesicatoria的植物细菌作阴性对 照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录C。 2 GB/T36851—2018 5.3.3实时荧光PCR检测 对于种子、植株等样品及纯培养菌可进行实时荧光PCR检测，具体步骤见附录D，对照设置同5.3.2 5.4分离培养鉴定 对于叶片和果实等植株样品，按照5.2.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在 mTMB和CKTM培养基平板上划线分离，重复3次。 对于种子样品，按照5.2.2的方法制备成样品悬浮液后，用无菌水进行10倍梯度稀释3次，各取 CKTM培养基平板上划线分离，各重复3次。 同时用已知的X.vesicatoria标准菌株接种上述两种半选择性培养基作为阳性对照。将所有培养 血平板置于26℃~28℃恒温培养箱中培养。分别于培养3d、5d、7d后进行观察。依据下述X.vesi- catoria病菌在各种选择性培养基上的菌落形态，挑选出可疑菌落在营养琼脂（NA)培养基上纯化2次～ 3次，随后进行分子生物学鉴定、致病性测定或Biolog鉴定。 在mTMB培养基上，X.uesicatoria菌落呈黄色、稍微黏稠、圆形、隆起。X.vesicatoria能利用吐 温，3d～7d后，在黄色菌落周围形成白色水晶状的晕圈。有些X.esicatoria菌株仅能形成模糊的晕 圈，或仅能在菌落背面形成透明晕圈或只是透明区（不明显）。 注：白色水晶状的晕圈是由于吐温被分解，钙沉积在透明区的结果。 X.vesicatoria在CKTM培养基上形成的菌落与mTMB上相似，呈黄色、稍微黏稠、圆形、隆起。 模糊的晕圈，或仅能在菌落背面形成透明晕圈或只是透明区（不明显）。 5.5Biolog鉴定 利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。 5.6致病性测定 选择2～3真叶期、容易发病的辣椒或番茄小苗（3周～4周）进行接种。使用无菌水将纯培养的菌 株配制成10°CFU/mL的细菌悬浮液。用无针头的注射器，轻轻使力，从叶背让细菌悬浮液渗透到叶 片里，每个菌株接种3株~5株，以清水做对照。在27℃～~32℃、8h～12h交替光照，90%～100%相 对湿度下培养，每天观察，并记录出现水渍病斑的时间。通常致病性的X.vesicatoria在2d～4d内形 成水渍状病斑。没有致病性的细菌在24h内