ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36840—2018 玉米内州萎菱蕉病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36840—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：高文娜、郑春生、骆卫峰、赵文军、易建平、张丽杰、边勇 GB/T36840-—2018 玉米内州萎蕉病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了玉米内州菱病菌（Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis）检疫鉴定方法。 本标准适用于玉米种子和玉米植株材料中的玉米内州菱病菌检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3基本信息 中文名：玉米内州菱為病菌 学名:Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis（Vidaver&Mandel1974)Davis etal.1984 简称：CMN 英文名:Goss's wilt,Goss's wilt of maize,Goss's bacterial wilt and leaf blight,blight of maize, leaf freckles of maize,wilt of maize,Nebraska leaf freckles and wilt,leaf freckles and wilt 分类地位：属细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，微球菌目Micrococcales，微球菌科Mi- crobacteriaceae，棒形杆菌属Clavibacter。 玉米内州菱蕉病菌的其他信息参见附录A。 4原理 玉米内州萎為病菌的症状特征、菌落形态特征、生理生化特性、PCR反应和致病性测试结果是检测 鉴定方法的依据。 SAC 5主要试剂与设备 5.1主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、乙醇、牛肉浸膏、聚蛋白 陈、酵母提取物、蔗糖、琼脂、葡萄糖。 培养基和缓冲液配方见附录B。 5.2仪器设备 显微镜、超净台、电子天平、高压灭菌锅、冰箱、移液器、离心机、培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像 系统、实时荧光PCR仪、Biolog鉴定仪等 1 GB/T36840—2018 6检测鉴定 6.1 现场检疫 按照SN/T2122规定的方法进行现场检疫并抽取样品。 6.2 实验室检测 6.2.1样品前处理 6.2.1.1种子样品 取100g种子样品放人三角瓶，加人200mL磷酸缓冲液（PBS缓冲液）（pH7.2），4℃浸泡过夜；滤 纸过滤后取浸泡液，10000r/min离心10min，1mLPBS悬浮沉淀，12000r/min离心5min，弃上清 液，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。样品如有种衣剂处理，先用自来水浸泡并洗去种衣剂。可用 纱布包裹搓洗数次。 6.2.1.2植物材料 有症叶片取病健交界处2mmX2mm组织，置于载玻片上，加一滴无菌水，加盖玻片，置于显微镜 下观察喷菌现象。如观察到喷菌现象，剪取5块～10块症状组织，每块10mm×10mm，剪碎后加人 1mL生理盐水，室温浸泡1h，取浸泡液12000r/min离心5min，1mL灭菌水悬浮沉淀；沉淀悬浮液离 心后沉淀提取DNA。 6.2.2PCR初检 样品DNA分别取1μL用于常规PCR或实时荧光PCR检测（见附录C和附录D），重复3次。 6.2.3病原菌分离 6.2.3.1种子样品 200mLPBS缓冲液（pH7.4），4℃浸泡过夜；120r/min振荡15min～30min，灭菌滤纸或纱布（4层~～ 8层）过滤，滤液室温静置15min，取上清液，10000r/min离心15min，1mL灭菌水悬浮沉淀。取 于后续试验。 6.2.3.2植物材料 若PCR检测为阳性，从症状组织的四个方向切取4个小块组织，每块均从病健交界处取5mmX 水，室温浸泡1h，取浸泡液在NA培养基平板上划线分离，划线5个～10个平板，27℃培养3d～5d。 6.2.4鉴定试验 SAG 6.2.4.1菌落形态特征 NA和sCNS平板上25℃培养6d后，典型菌落淡黄色或杏橙色，圆形，扁平，或稍凸起，边缘光滑， 有光泽。挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。 2 GB/T36840—2018 6.2.4.2PCR检测 分离物菌落纯化后，菌体提取DNA后进行PCR检测或实时光PCR检测，检测程序见附录C和 附录D。PCR检测阳性的分离物进行后续测试。 6.2.4.3Biolog测试 分离物在NA上培养后转移至BUG培养基（见附录B）上，33℃培养24h，按照Biolog使用说明， 调整分离物菌悬液浊度加人BiologGN微孔板或GⅢ微孔板中，每孔100uL。微孔板33℃培养18h 后用Biolog仪读数，获得测试结果。 6.2.4.4烟草过敏性反应 分离物在NA上28℃培养48h～72h后用无菌水配成108CFU/mL的菌悬液，采用组织渗透法 接种普通烟叶背面，以无菌水作为对照，28℃光照培养24h～48h后观察是否产生过敏性反应 6.2.4.5致病性测试 分离物108CFU/mL菌悬液针刺接种玉米幼叶，进行致病性测试。选取健康甜玉米种子种植，在 生出2片幼叶后，针刺小孔，接种菌悬浮液，保湿1d，室温下生长。接种7d～10d后观察接种点附近出 现症状。根据柯赫氏法则，对发病子叶再分离病原菌，分离的病菌用PCR进行检测，完成了整个测试 程序。 7结果判定 分离物的菌落形态特征与CMN相符,Biolog测试为CMN,PCR检测结果为阳性，烟草过敏性反应 为阳性，致病性测试出现典型症状，判定为CMN。 8样品保存 阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核、谈判和仲裁；阳性的植物材料及时销毁处 理；分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28℃培养48h。然后置于4℃冰箱中保存， 定期（30d）转接；或在菌悬液中加入15%30%甘油于一80℃下保存；必要时可将菌株冻干，一80℃ 下长期保存。 3 GB/T368402018 附录A （资料性附录） 玉米内州萎蕉病菌相关资料 A.1形态特征 玉米内州菱蕉病菌属革兰氏染色阳性，大小约为（0.6μm～0.7μm）X（0.7μm~1.2μm），大部分为 楔形细胞，也存在球状细胞，直或弯的杆状细胞。好氧，不抗酸，不产芽孢，无鞭毛，最适生长温度为 26℃~27℃，最高生长温度37℃～38℃。 A.2地理分布 美国（科罗拉多州、伊利诺斯州、印第安纳州、爱荷华州、堪萨斯州、路易斯安那州、密歇根州、明尼苏 达州、密苏里州、内布拉斯加州、北达科他州、南达科他州、得克萨斯州、威斯康星州和怀俄明州），加拿大 （阿尔伯塔、马尼托巴和安大略）。 A.3寄主植物 主要寄主是玉米Zeamays。接种能侵染假蜀泰Echlaenamericana，甘蔗Saccharum officinarum，高梁Sorghumbicolor，苏丹草S.sudanense，鸭茅状摩擦禾Tripsacumdactyloides。 A.4传播途径 病菌可以侵染玉米植株的任何部位，在玉米叶、茎杆、穗轴和穗等病残体上越冬，存活期长达10个 月。种子的自然侵染率可达20.8%。病菌侵染主要经由伤口侵人。近距离传播主要依靠雨水或灌溉 水，远距离传播主要靠种子，种子内外均可带菌，种子中病菌至少存活1年，该病害是典型的种传植物细 菌病害。 A.5为害症状 症状表现为叶片萎為和系统枯萎两种类型。该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿 色至黑色，后变褐色，与叶脉平行（参见图A.1），表面常有细菌溢脓。系统侵染时，维管束变色，根和近 地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。玉米幼苗和成株均可发病。细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵 染或者细嫩植株的根和茎秆系统侵染引起发病。苗期侵染引起萎爲、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶 片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有时有黑色斑点，最后干枯。 4 GB/T 36840—2018 图A.1玉米内州萎蕉病菌侵染造成的叶片萎症状 5