ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36832—2018 黑高梁检疫鉴定方法 Detection and identification of Sorghum almum Parodi. 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36832—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：印丽萍、薛华杰、吴志毅、傅怡宁、张宁。 GB/T368322018 黑高梁检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了黑高梁检疫鉴定的形态学方法和分子筛查方法。 本标准适用于黑高梁的检疫鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 小穗spikelet 小型的穗状花序或次级穗状花序，由两枚苞片（颖片）包裹的一至多花组成的末级花穗 2.2 小花 floret 由禾本科的花同包被其外的内外荐组成的结构。 2.3 小穗轴 rachilla 每个小穗有一短轴，其上着生1朵至多朵小花。 2.4 片 squama 禾本科小穗上的小花外面的两片苞片。 注：在外一片为外（lemma），包着的内部一片为内（palea）。 2.5 颖片glume 禾本科植物基部的苞片。 注：基部常有一对，生下面或外面的一片称第一颖（firstglume)，生上方或里面的一片称第二颖（secondglume)。 3基本信息 3 学名：Sorghum almum Parodi. 英文名:Columbus grass,almum grass,almum sorghum 中文名：黑高粱、杂高粱 分类地位（恩格勒系统）：被子植物门Angiospermae，单子叶植物纲Monocotyledoneae，禾本目 Poales，禾本科Poaceae，高梁族Andropogoneae，高梁属SorghumMoench。 分布：阿根廷、美国、智利、新西兰、澳大利亚、南非、加拿大、俄罗斯。 传播途径：黑高梁常以种子（小穗）形式混人粮谷物、羊毛等植物产品中，随货物调运进行传播。 其他信息：高梁属形态学等信息描述参见附录A。 黑高梁是多年生植物，为假高梁与苏丹草LS.sudanense（Piper）Stapf或与野（喀麦隆）高梁 [S.arundinaceum（Desv.）Stapf］的杂交种。黑高梁与同属的假高梁、苏丹草、光高梁、拟高粱等近似 1 GB/T368322018 种难以区别。其小穗（小花、颖果）形态区别见附录B。 4仪器和用具 4.1 仪器设备 体视显微镜（10×~40×）、放大镜、孔筛（孔径5.0m、3.5mm、2.5mm、1.5mm、1.0mm） PCR仪、电子天平（1/10000g）、pH计、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解部 镜、涡旋振荡器、冰箱、微波炉。 4.2用具 白瓷盘、载玻片、解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、指形管、标本盒、标本瓶、标签、樟脑、干燥剂、可调式 微量移液器（2μL10μL、20uL、100μL、200μL，1000μL）及相应的吸头、微型离心管PCR管、直径 3.0mm的灭菌钢珠等。 4.3主要试剂 植物基因组提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱 氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Taq聚合酶、1OXPCR缓冲液。CTAB法提取试剂，见附录C中C.1。 5实验室检测和鉴定 5.1样品检测 5.1.1粮谷类、油籽类 直径大于或等于5.0mm的样品，如大豆、玉米、菜豆等，建议选取孔径为的5.0mm和1.5mm的 圆孔筛，双层筛样；直径在2.5mm～5.0mm的样品，如大麦、小麦、亚麻籽、高梁等，可采用3.5mm和 2.5mm圆孔筛，双层筛样；如直径小于或等于2.5mm的样品，如芝麻，油菜籽等，可采用2.5mm和 1.0mm圆孔筛，双层筛样 分次将样品倒入上层筛中，每次样品量不超过上层筛内高度的1/2。每次筛样，同一方向近同一平 面旋动10次20次。筛样完毕后，将每层筛上物和筛下物分别倒白瓷盘中。 用载玻片仔细拨动上层筛的筛上物，并用镊子将疑似黑高梁的种子（小穗）放入培养血中，待镜检。 在样品倒入白瓷盘、筛样等过程中，发现的疑似黑高梁的植株应挑出，放人白瓷盘中，待镜检 5.1.2原羊毛、落毛 将原羊毛、落毛在白磁盘中展开，仔细检查混入的杂草。 将疑似黑高梁的植株挑出，放白瓷盘中，待镜检。 用镊子将疑似黑高梁的种子挑出，放入培养血中，待镜检。 5.1.3集装箱残留物 将集装箱残留物倒入白瓷盘中，摊平，仔细检查。 将疑似黑高梁的植株挑出，放入白瓷盘中，待镜检。 2 GB/T36832—2018 5.2镜检 在解部镜或放天镜下镜检。进行植株花部特征和小穗内部特征观察时，辅以解部刀、解部针等 工具。 5.3鉴定方法 5.3.1形态学鉴定 5.3.1.1茎 根状茎，短而弯曲。 秆，直立，不分枝或有时自下部节上分枝；高1.8m~2.8m，有时可达4.5m，直径6mm~110mm； 8节～10节；秆节间，实心，长7cm～40cm，光滑，上部无毛；秆节被短柔毛。黑高梁的根状茎形态参见 附录D中图D.1。 SAC 5.3.1.2叶 叶鞘无毛或基部有柔毛；叶舌，长2.5mm～3.5mm，硬膜质，顶端近平截，无毛；叶片表面光滑，无 毛，线形至线状披针形，长25cm～50cm，宽2cm～5cm，中部最宽，向两端渐狭窄，中脉白色，边缘软 骨质，具微细的小锯齿。黑高粱的叶鞘形态参见图D.1。 5.3.1.3花序 圆锥花序长约40cm，分枝较细而斜升，单生或数枚在主轴上轮生或近一侧着生，基部腋间具灰白 色柔毛；每一总状花序具2节～5节，下部裸露部分长1.5cm～4.0cm；总状花序轴与小穗柄不易折断。 黑高梁的花序形态参见图D.1。 5.3.1.4小穗 无柄小穗椭圆形或长椭圆形，长5.5mm~6.5mm，上端具柔毛或近于无毛，宽1.5mm~2.0mm， 成熟后黑色或黄绿色，不脱落或迟缓脱落，基盘钝，具短柔毛；颖坚纸质或薄革质，第一颖具5脉～7脉， 上部明显，除背部的毛较蔬或无毛外，其余部分的毛较多，第二颖上部具脊。无柄小穗内含2小花，第一 小花不育，第一外椭圆形，膜质透明，边缘具纤毛，2脉；无明显内。第二外披针形，顶端钝或微 尖，膜质，具2脉，第二内顶端多少2浅裂；芒细弱，长约10.0mm，自第二外裂缝间伸出；鳞被2枚 宽倒卵形，顶端微凹，无毛；雄蕊3枚；子房椭圆形。有柄小穗雄性，较无柄小穗狭窄，颖的质地较薄。黑 高梁的小穗形态参见图D.2。 5.3.1.5颖果 颖果卵形或椭圆形，栗色至淡黄色。长3.0mm~3.8mm，宽1.8mm~2.0mm，厚约1.1mm。黑 高梁的颖果形态参见图D.3。 5.3.2DNA条形码筛查鉴定方法 5.3.2.1样品的处理 将需要提取DNA的植物材料（种子为2粒～3粒，硅胶干燥的叶片为10mg），放入2mL的微型离 (30 次/s)。 3 GB/T36832—2018 5.3.2.2DNA制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的 CTAB法方法见附录C。 5.3.2.3DNA条形码基因片段扩增 利用trnT-trnL的引物进行序列扩增。引物序列见附录E中E.1，反应体系见E.2,反应程序见 E.3。 5.3.2.4PCR产物的检测 取PCR产物10μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 trnT-trnL引物可得到800bp左右的扩增片段 5.3.2.5测序 使用商业化的DNA产物纯化试剂盒对剩余的PCR扩增产物进行纯化并测序。测序引物与PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列 5.3.2.6比对 PCR产物，经处理后得到721bp～722bp大小的片段。引物处理后的片段测序结果进人NCBI。 登录NCBI数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对获得的序列进行 比对。 5.4结果评定 5.4.1形态学的结果判定 以成熟植株和（或）果实（颖果）形态特征为依据，符合上述5.3.1形态特征描述的，鉴定为黑高梁。 5.4.2DNA条形码筛查鉴定方法的结果判定 基于trnT-trnL序列，若序列相似性为100%，则判定为黑高梁；若序列相似性小于100%，则需结 合形态学进行进一步判定。比对参考序列见E.4。 6样品保存 6.1标本保存 将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存，并注明来源，寄主，采集 时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则保存到纠纷解决完毕。 6.2原始数据保存 样品检测结束后，将原始记录单（应包括DNA序列及测序峰图等内容）和检验报告归档，妥善保 管，以备复验、谈判和仲裁， 4 GB/T 36832—2018 附录A （资料性附录） 高梁属基本生物学信息 高大的一年生或多年生草本；具或不具根状茎。秆多粗壮而直立。叶片宽线形、线形至线状披针 形。圆锥花序直立，稀弯曲，开展或紧缩，由多数含1节～5节的总状花序组成；小穗李生，一无柄，一有 柄，总状花序轴节间与小穗柄线形，其边缘常具纤毛；无柄小穗两性，有柄小穗雄性或中性，无柄小穗之 第一颖革质，背