ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36824—2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Mycosphaerella pini E.Rostrup 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36824—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国安徽出人境检验检疫局 本标准主要起草人：李云飞、宗凯、姚剑、孙娟娟、华陈意、郑海松、余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满、 谢超。 GB/T36824—2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了松属（Pinus）、其他寄主植物及植物材料中松针红斑病菌检疫和鉴定方法， 本标准适用于松属及相关种属苗木、枝叶中松针红斑病菌的检疫和鉴定 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3松针红斑病菌基本信息 3 中文名：松针红斑病菌。 学名:Mycosphaerella pini E.Rostrup apud Munk(Envans,1984)。 异名:Eruptiopini（Rostr.）M.E.Barr Scirrhia pini Funk &. A.K. Parker Cytosporina septospora G. Doroguine Septoriella septospora (G. Dorog.) Sacc. Actinothyrium marginatum Sacc. Dothistroma pini var.lineare Thyr &C.G.Shaw Dothistroma septosporum var. lineare Thyr & C. G. Shaw Dothistroma pini var. keniense M. H. Ivory Dothistroma septosporum var.keniense M. H.Ivory Dothistroma pini sensu auct, NZ Dothistroma septosporum (G. Dorog.) M.Morelet Dothistroma septosporum (G.Dorog.)M.Morelet var.septosporum Septoria septospora (G. Dorog.) Arx 分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），煤目（Capno- diales），球腔菌科（Mycosphaerellaceae），球腔菌属（Mycosphaerella）。无性型为Dothistromasepto sporum（Dorog.）Morelet。松针红斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 本方法以松针红斑病菌的为害症状，形态特征、培养性状及分子生物学特征作为检疫鉴定的主要依 据，寄主及地理分布作为辅助鉴定依据。 5 器材和试剂 5.1器材 透视显微镜、超净工作台、电子天平、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷 1 GB/T368242018 冻离心机、荧光定量PCR仪、可调移液器（1000μL，200μL，20μL，10μL，2.5μL）、培养皿、烧杯、三角 瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、移植环、研钵、液氮罐、标签等。 5.2试剂 无水乙醇、次氯酸钠、CTAB缓冲液、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、液氮、实时荧光PCR预混液、引 物和探针，麦芽浸膏琼脂培养基（MEA）：2%麦芽浸膏、2%琼脂、PH值为5士0.2。 6抽样方法 按SN/T2122进行抽样。 7现场查验 检查幼苗、针叶是否有浅绿色、黄色至红褐色的病斑，针叶是否坏死、脱落。观察坏死针叶是否为针 叶尖端坏死、病斑上是否有红褐色斑点、段斑以及黑色斑点（参见附录B）。将疑似感病样品或无症样品 标识清晰后带回实验室做进一步检验。 8实验室检验 8.1切片检验 选取疑似感病样品，剪取带有黑色斑点或凸起裂口的针叶组织（约5mm），用刀片对有黑点或裂口 组织块进行徒手切片，用移植环将切薄的组织片移至载玻片中央的水滴中，在显微镜下观察子囊座、子 囊孢子或分生抱子盘、分生孢子等病原菌相关特征。如针叶病斑上未发现黑点或裂口，可将有病针叶在 20℃条件下保湿培养约20d，观察是否长出黑点或裂口，若长出则进行切片镜检。如针叶病斑组织切 片中的子囊座或分生孢子盘尚未见成熟的孢子，可将有病针叶在20℃下保湿培养1d～2d，待孢子成 熟后再做切片镜检。 8.2分离培养 在典型病斑中切取小块感病组织或无症针叶组织（约5mm），将该组织在1%次氯酸钠中浸泡 10min。用无菌水冲洗3次后置于麦芽浸膏琼脂平板上，20℃恒温光照（16h光照，8h黑暗）培养 2周～4周后镜检。期间要仔细观察菌落的生长状态并做记录 8.3形态观察 从菌落中挑取少许培养物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察。 8.4实时荧光PCR检测 松针红斑病菌的实时荧光PCR检测方法见附录C。 9病菌形态特征 9.1有性阶段 子囊座在落叶上形成，通常位于红斑区，最初埋生于表皮下，成熟后不规则地或通过1个～2个沿 针叶轴向的裂缝突出于表皮（参见附录B）。子囊座黑色，大小为（400μm1000μm）×（300μm~ 2 GB/T 36824—2018 400μm），具单或多腔。子囊为囊状至圆柱状，双囊壁，大小约为（35μm~55μm）×（6μm～9μm），内 有8个子囊孢子，子囊抱子呈透明椭圆形，具圆形先端，具1个分隔，通常有4个油滴状斑点，天小 (10 μm~15 μm) X(3 μm~4 μm)。 9.2无性阶段 病菌不规则地分布于坏死区、部分死亡针叶组织上，有时会聚集于红斑处。分生孢子盘最初埋生于 针叶表皮下，呈腔室状，成熟时呈椭圆形，平行于针叶长轴排列。分生孢子盘黑色，大小为（300μm～ 会分泌白色透明的分生孢子黏液，分生孢子透明、薄壁、光滑、直或略弯，梭型至棍棒型，1个～5个分隔， 多数为2个~3个分隔，具有圆形先端和截型基部，（12μm~48μm）×（2μm~3μm）。 9.3培养性状 松针红斑病菌在MEA平板上生长速度较慢（相对于松针褐枯病和松针褐斑病），最初产生灰白色 气生菌丝，逐渐变为灰褐色至黑色，菌落凸起呈爆裂状，在MEA平板上形成轻微的红褐色色斑。在 20℃下菌丝每周生长1.5mm~2.0mm，菌丝生长最适温度为20℃25℃，菌丝生长最适pH值为 3~5。 9.4与近似种的区别 松针红斑病菌与近似种的区别见表1。 表1松针红斑病菌与近似种的区别 松针红斑病菌 松针褐斑病菌 松针褐枯病菌 名称 Mycosphaerella pini Mycosphaerella dearnessii Mycosphaerella gibsonii 无色，壁薄、光滑。大小为 茶褐色或烟褐色，壁厚、上布黑色 淡黄褐色，壁薄、光滑。分生孢子大 分生孢子 (12 μm~48 μm) X(2 μm~ 疣状突起。分生孢子大小为 小为（20μm~68μm）×(2.5μm~ SAC 3 μm) (1l μm~64 μm)X(1 μm~6 μm) 4.5 μm) 在MEA培养基上生长缓慢， 在MEA培养基上生长速度略 20℃下菌落直径每周生长 快，20℃下菌落直径每周生长 在MEA培养基生长速度最快，菌 培养性状 1.5mm~2mm。菌落呈灰 2.5mm~3mm。菌落呈绿色至 落呈灰色毛绒状 色、棕色至黑色。平板上形成 黑色，有橄榄绿色的孢子黏液。 轻微的红褐色色斑 平板上产生黄色色斑 松针上病斑浅绿色、黄色至红 症状 松针上病斑褐色 松针上病斑浅绿色、黄褐色至灰色 褐色 10结果判定 如果样品具有该病的典型症状，且切片或分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符，即可判定 为检出松针红斑病菌；如果分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符，且实时荧光PCR检测为阳 性，亦可判定为检出松针红斑病菌。 11 样品、菌种保藏 分离菌转接在MEA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4℃保存，定期转接，有条件可进 行冷冻干燥保存。检出病菌的样品标识清晰后妥善保存6个月，保存期满灭活处理。 3 GB/T36824—2018 附录A （资料性附录） 松针红斑病菌的其他信息 A.1为害症状 感病针叶首先出现黄色斑点，之后逐渐变大具有明显界限的环绕针叶轴向的条带，最终导致针叶先 端死亡。该病的典型症状是褐色条带周围有一环绕针叶轴向的砖红色区域，然而该症状的出现取决于 寄主植物及感病位置，有些情况下并不出现。有时，砖红色色素会缩减为小红点分布于子实体结构周 围。感病针叶一般呈先端死亡、具有环带状患病部或坏死区，且具有绿色基底。严重感病的针叶会整体 变褐色，过早落叶，老叶先落；轻度感病的叶片，落叶病症会延迟1～2年出现。严重感病松树的典型症 状是只有当年生针叶，反复感染会导致枝条或整株树的死亡。 A.2寄主 樟子松（P.sylvestrisvar.mongolica）、红松（P.koraiensi）、油松（P.tabulaeformis）、长白松（P.syl