ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36822—2018 瓜类果斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Acidovorax citrulli 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36822—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、深圳市检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民 共和国新疆出人境检验检疫局、中国农业科学院植物保护研究所、国家瓜类工程技术研究中心、江苏省 植物保护植物检疫站 本标准主要起草人：赵文军、冯建军、田茜、田艳丽、张祥林、赵廷昌、胡白石、龚伟荣。 GB/T36822—2018 瓜类果斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了瓜类果斑病菌的症状观察、分离培养、免疫学及分子生物学检测方法。 本标准适用于可能带有瓜类果斑病菌的西瓜、甜瓜等葫芦科作物植株及种子的检疫鉴定， 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1465西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 3瓜类果斑病菌基本信息 学名:Acidovora citrulli(Schaad et al.) Schaad et al.,2008 异名:Acidovorar avenae subsp.citrulli(Schaad et al.,1978)Willems et al.,1992 Pseudomonas avenae subsp.citrulli(Schaad et al.,1978) Hu et al.,1991 Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.citrulli Schaad et al.,1978 传播途径：主要通过带菌种子进行远距离传播，田间扩散主要依靠雨水、农事操作和昆虫传播 瓜类果斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 根据瓜类果斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养；根据 瓜类果斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据瓜类果斑病菌的特异性DNA序列进行 分子生物学检测。 C 仪器设备 5.1PCR仪：温度范围4℃~99℃，控温精度士0.25℃。 5.2 实时荧光PCR仪：温度范围4℃~99℃，控温精度士0.25℃。 5.3电泳仪：输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA。 5.4杂交炉：温度范围室温至99.9℃，控温精度土0.1℃。 5.5凝胶成像分析仪：光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光 片、机载头像捕提软件、图像分析软件。 5.6显微镜：目镜放大倍数10，物镜放大倍数100。 高速冷冻离心机：最大转速15000r/min。 5.8 恒温培养箱：温度范围5℃65℃，波动度士0.5℃。 5.9 超净工作台：高效滤膜可除去99.99%以上的0.3μL粒子。 1 GB/T36822—2018 5.10 灭菌锅：最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105℃~135℃。 5.11 台式小型离心机：最大转速7000r/min。 5.12 超低温冰箱：一80℃。 5.13 常规冰箱：4℃。 5.14 小型电动粉碎机：电机转速20000r/min。 5.15 全钢大号指甲钳：10cmX1.5cm。 5.16 旋涡振荡器：最大转速为2800r/min。 5.17 微量进样器：2.5μL10μL，20μL，100μL，200μl1000μ 6主要试剂 6.175%乙醇。 6.21%次氯酸钠。 6.3生理盐水。 6.40.01mol/L磷酸缓冲液：氯化钠（NaCI)7.9g，氯化钾（KCI)0.2g，磷酸氢二钠（NazHPO,)1.44g， 磷酸二氢钾（KH,PO)0.24g，溶于800mL蒸馏水中，用盐酸（HCI)或氢氧化钠（NaOH)调节溶液的 pH至7.0,最后加蒸馏水定容至1L。 6.5PCR凝胶电泳检测试剂见附录B。 6.6实时荧光PCR检测试剂见附录C。 6.74 锁式探针检测试剂见附录D。 6.8 BNAKB、EBBA及TWZ培养基配方见附录E。 7田间观察检测 7.1症状观察 对于植株样品，参照附录A中的症状描述观察有无瓜类果斑病的典型症状，对出现典型症状或可 疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机 采样。 7.2现场检测 利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测，按照说明书进行操作及结果判定 8实验室检测鉴定 8.1样品制备 8.1.1植株样品 对于有症状植株，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜的病 健交界处组织（对于无症状样品，随机选取植物组织），切成0.5cmX0.5cm左右的小块，用75%的乙醇 （或1%的次氯酸钠）进行表面消毒，晾干，放入装有1mL无菌水的2mL离心管中，用灭菌玻棒捣碎， 制成悬浮液，1000r/min离心1min，弃去沉淀，上清液转入另一干净的2mL离心管中。可将2份～ 3份同一样品的悬浮液合并成一管，最终制成1mL～2mL悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及分子 生物学检测。 2 GB/T36822—2018 8.1.2种子样品 对于种子样品，根据实验室条件，可利用种植观察法，亦可直接进行免疫学或分子生物学检测。 种子样品制备：随机抽取待检瓜种300g左右，平均分成3份～5份，将种子剥开（如利用灭菌的大 号指甲钳刀），或用微型粉碎机轻微破碎（至2/3以上种子破碎），加人适量pH7.0的0.01mol/L磷酸 缓冲液或生理盐水，使种子完全浸没，室温振荡4h（100r/min左右），4℃浸泡过夜。将浸泡液 1000r/min离心1min，去沉淀，上清液10000r/min离心10min，弃上清液，取沉淀。用无菌水悬浮， 制成1mL～2mL样品悬浮液，用于分离培养、免疫学检测以及分子生物学检测 8.2种植观察 种植观察法：取30000粒～50000粒种子，或根据实际情况取适量种子，于24℃～35℃（最适 29℃），相对湿度70%以上，种植18d，观察症状。若观察到疑似症状，初步判定为阳性，再用免疫学、 分子生物学方法或分离培养方法检测。 8.3免疫学检测 利用商品化ELISA检测试剂盒进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。 8.4分子生物学检测 8.4.1模板制备 提取试剂盒提取，提取核酸一20℃保存）用于分子生物学检测。 8.4.2PCR凝胶电泳检测 对于种子，以健康的瓜种子和带果斑病菌的瓜种子洗涤液作为阴性对照和阳性对照。对于植株样 品，以已知感染瓜类果斑病的植物病组织或标准菌株做阳性对照，用健康植物组织做阴性对照，用双蒸 水代替模板作为空白对照进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录B。 8.4.3实时荧光PCR检测 检测步骤见附录C，对照设置见8.4.2。 8.4.4锁式探针技术检测 检测步骤见附录D，对照设置见8.4.2。 8.5分离培养鉴定 用灭菌接种环蘸取8.1方法制备的样品悬浮液在半选择性培养基EBBA或TWZ上划线分离，同 时，将悬浮液进行10×梯度稀释3次，各取100μL稀释液涂布培养血皿，重复3次，28℃恒温培养48h， 挑取疑似菌落进行转接纯化，菌落形态特征参见附录A，再采用8.3或8.4方法进一步鉴定。 9结果判定 9.1植株样品 对于有典型症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出瓜类果斑病菌。无 3 GB/T36822—2018 症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果阳性，分离培养鉴定为阳性，判定检出瓜类果斑病菌。其 中，分子生物学检测可根据实验室条件，选择8.4.2、8.4.3或8.4.4中的任意一种进行检测，任意一种检 测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性。 9.2 种子样品 种子经种植观察有症状，且免疫学或分子生物学结果为阳性，即可判定该种子样品检出具有活性的 瓜类果斑病菌。 离培养鉴定为阳性，确定种子样品检出具有活性的瓜类果斑病菌。 其中，分子生物学检测可根据实验室条件，选择8.4.2、8.4.3或8.4.4中的任意一种进行检测，任意 一种检测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性。 10 样品及检测结果保存 10.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出瓜类果斑病菌的样品应妥善保存，以备复核。该类 样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 10.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为瓜类果斑病菌的菌株，应妥善保存。可采用甘油保存或冻干保存。对 不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。 10.3结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和 审核人员的签字。现场检疫发现的可疑症状等应及时拍照保存，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照 片，分子生物学检测方法需有原始实验数据及相关结果图片。 4 GB/T 36822—2018 附录A （资料性附录） 瓜类果斑病菌其他信息 A.1名称与分类地位 中文名称：瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌、西瓜细菌性果腐病菌 英文名称：bact