ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36821—2018 花生黑腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Calonectria ilicicola Boedijn & Reitsma 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36821—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、中华人民共和国威海出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局 本标准主要起草人：李金庆、张京宣、鲁闽、粟智平、王颖、段效辉、李春喜、王简、张卫东、吕文诚 刘鹏。 1 GB/T 36821—2018 花生黑腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了花生黑腐病菌（Calonectria ilicicolaBoedijn&Reitsma)的检疫鉴定方法。 本标准适用于花生、大豆等寄主植物及植物产品、土壤等传带的花生黑腐病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122一2015进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3花生黑腐病菌基本信息及分类地位 病害英文名:Black rot of peanut,Red crown rot of soybean 有性阶段学名：Calonectriailicicola Boedijn&Reitsma，异名：Calonectria crotalariae （Loos） Bell &. Sobers Calonectriailicicola隶属于子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），粪壳菌亚纲（Sor dariomycetidae），肉座菌目（Hypocreales），丛赤壳科（Nectriacea），丽赤壳属（Calonectria）。 无性阶段中文名：花生黑腐病菌，寄生帚梗柱孢霉，寄生柱枝孢 无性阶段学名：CylindrocladiumparasiticumCrous，Wingfield&.Alfenas，异名： Cylindrocladium crotalariae(Loos) Bell & Sobers Cylindrocladiumparasiticum隶属于有丝分裂孢子真菌类（Mitosporicfungi），丝孢纲（Hyphomy cetes），丝孢目（Hyphomycetales），丝孢科（Hyphomycetaceae），帚梗柱孢属（Cylindrocladium）。 花生黑腐病是典型的土壤传播和种子传播病害，具有危害严重、传播迅速和较难防治的特点。该病 病原菌广泛分布于土壤中，除能为害花生、大豆等豆科植物外，还能引起茶树、油加利树等植物的叶斑 病。病菌先侵染子叶使其变黑腐烂，继而侵染幼苗根茎部。潮湿环境下，病部长出许多霉状物覆盖茎基 部，茎叶失水萎死亡。在田间常与花生新赤壳基腐病相混淆（表A.1）。花生黑腐病菌在10℃～ 30℃范围内均能生长，最适生长温度为25℃～28℃。病菌在世界上的分布、寄主植物、发病症状及与 近似病害的比较等其他信息参见附录A。 4方法原理 依据花生黑腐病菌在寄主上的症状、形态学特征和PCR特异性扩增等进行检测鉴定。 1 GB/T 36821—2018 5主要仪器设备 5.1 仪器设备 5.1.1 生物显微镜：放大倍数40×~1000×。 5.1.2 体视显微镜：放大倍数1.95×～250×。 5.1.3 生物安全柜：符合EN12469：2000标准。 5.1.4 高压灭菌器：灭菌工作温度105℃~138℃ 5.1.5 光照生物培养箱：温范围0℃~50℃，温度波动度士0.5℃，温度均匀度士1℃，光照度0lx~ 3 500 lx。 5.2 试验用具 5.2.1 滤纸：尺寸110mm，等级中速 5.2.2 手持放大镜：放大倍数10倍，直径90mm。 5.2.3 培养皿：直径90mm。 5.2.4 烧杯：100mL,250mL,500mL,1000mL,2000mL 5.2.5 试管：15mmX150mm。 5.2.6 量筒：500mL，l000mL。 5.2.7 移液器吸头：10μL，200μL，1000μL。 5.2.8 离心管：1.5mL。 5.2.9 其他：手术刀、手术剪、镊子、酒精灯、研钵、载玻片、盖玻片。 6试剂和培养基 6.1试剂 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。PCR反应体系用双 蒸水。 6.1.1五氯硝基苯（CCl,NOz）。 6.1.2 噻菌灵（CioH,N,S）。 6.1.3 金霉素（C22H2:CIN,Og）。 6.1.4 氯霉素（CnH2Cl,N,O,）。 6.1.5 氯硝胺(CH,Cl,NO2）。 6.1.6 硫酸链霉素（C42HsNiO36S）。 6.1.7 70%乙醇(C,H,OH)。 6.2 试剂配制 6.2.1 次氯酸钠溶液（0.26%）：取有效氯含量为10%的次氯酸钠溶液25mL加水稀释至1000mL。 6.2.2 次氯酸钠溶液（0.5%）：取有效氯含量为10%的次氯酸钠溶液48mL加水稀释至1000mL。 6.2.3 硫酸链霉素溶液（0.1%）：取0.1g硫酸链霉素加水溶解，并定容至100mL。 6.3 培养基 培养基配置方法及步骤见附录B。 2 GB/T36821—2018 7鉴定 7.1取样方法 按SN/T2122—2015中5.1和5.2规定的取样比例进行取样。 7.2症状检查 症状检查参见附录C。 逐一对取样产品进行症状观察。观察收集的寄主植株茎基部和根系是否变黑腐烂（图C.8、图 C.12），病株茎基部、果针和豆荚是否产生大量成簇橙红色至深红色子囊壳（图C.7），叶片是否有退绿变 黄症状（图C.8、图C.11）。重点观察花生果荚是否变黑（图C.10），种皮表面是否有肉桂色或深棕色斑点 （图C.9），这些斑点可能是寄生帚梗柱孢霉的菌丝体或微菌核。疑似的病残体和病子粒要带回实验室 进行显微镜检查和病原菌分离，可轻轻刮取病株表面橙红色子囊壳在体视显微镜下观察，挑取子囊壳制 作玻片，轻压后可见大量子囊喷出（图C.6）。 7.3分离培养 7.3.1种子携带病原分离 消毒1min，经灭菌水清洗3次后移至含有五氯硝基苯、噻菌灵、金霉素、氯霉素、氯硝胺的选择性培养 基中25℃黑暗培养观察，待菌落出现挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化，获得纯化菌株 7.3.2植株及残体携带病原分离 将采集到的病样冲洗干净，从茎基部病健交界处切下5mm见方组织，经75%乙醇处理1min后， 用0.5%次氯酸钠表面消毒3min，在灭菌水中清洗3次后去除组织表面多余水分，置于加有0.1%硫酸 链霉素的PDA培养基上，于25℃黑暗培养48h，挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化，获得纯化菌株。 7.4形态学鉴定 形态学鉴定参见附录C。 挑取上述纯化好的菌株移至V8汁培养基上，28℃黑暗条件下培养，大约7d后观察菌落形态特 征，2周后用水作浮载剂制成玻片，镜检，观察菌丝、分生孢子（图C.4）、微菌核（图C.5）的形态特征，3周 后观察菌落中橙色至深红色子座，用针挑取子座，用水作浮载剂制成玻片，在显微镜下观察有性繁殖器 官，如子囊壳、子囊、子囊抱子（图C.6）等。 7.5PCR特异性扩增检测 PCR扩增检测方法见附录D。 7.6测序 如果7.5中PCR扩增结果为阳性，应将PCR扩增产物进行测序比对，以进一步确证是否是花生黑 腐病菌。 3 54 GB/T368212018 8鉴定特征 8.1形态学特征 形态学特征参见附录C。 花生黑腐病菌在PDA培养基上产生白色至鹅黄色菌丝，菌落平伏，质地致密，并产生褐色至深褐 色色素渗人到培养基中（图C.1、图C.2）。在V8汁培养基上产生灰白至白色菌丝，菌落质地稀疏，边缘 整齐，为规则的圆形，但在V8汁培养基上不产生任何色素。花生黑腐病菌在V8汁培养基产生的微菌 核（图C.5）、分生孢子（图C.4）和子囊壳最多。分生孢子梗呈扫帚状，二叉或三叉分支（图C.3），孢梗顶 端为产抱细胞，瓶状，顶端无色。分生抱子圆柱状，直立，透明，1个～3个隔膜，多为3个，大小为 (27.3um～70.9um）X（4.1μm～6.8μm）。有性时期子囊壳橙红色至深红色，倒卵形或梨形，单生，大 无色，棍棒状，具长柄，内含8个子囊孢子。子囊孢子无色，长纺锤形至镰刀形，略弯曲，两端钝圆，具1 个~3个分隔，大小（27.3μm~54.5um）×（4.1um~6.8μm），分隔处常缢缩。 8.2 PCR检测特异性产物 用花生黑腐病菌特异性引物进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳检测中可观察到279bp的PCR产 物条带（见附录D）。 9结果判定 若分离菌的形态学特征符合8.1中花生黑腐病菌的病原特征，且PCR扩增检测结果为阳性，并经 测序比对与花生黑腐病菌的序列相似性在99%以上，可判定检测结果为检出。 10 菌种保存 将分离出来的真菌接种在V8汁培养基斜面上，待斜面表面布满菌丝后，封好斜面瓶口，置于4℃ 保存。 4 GB/T 36821—2018 附录A （资料性附录） 花生黑腐病菌其他信息 A.1分布 亚洲：日本、印度、韩国、朝鲜、印度尼西亚、斯里兰卡、伊朗、