ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36807—2018 杨树（细菌性）枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Enterobacter cancerogenus (Urosevi) Dickey et Zumoff 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36807—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、中华人民共和国沈阳出人境检验检疫局、中华人民共和国南海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李金庆、厉艳、段效辉、张京宣、付海滨、封立平、谈珺、管旭芳、栗智平、王简、 刘宁、王英超、耿金培。 GB/T368072018 杨树（细菌性）枯萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了杨树（细菌性）枯菱病菌[Enterobactercancerogenus（Urosevi）DickeyetZumoff的 检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境苗木、原木等植物及其产品中杨树（细菌性）枯萎病菌的检疫鉴定 2杨树（细菌性）枯萎病菌基本信息 中文名：杨树（细菌性)枯萎病菌 学名:Enterobacter cancerogenus （Urosevi)Dickey et Zumoff 异名：Erwinia cancerogena Urosevic 1966 英文名：Cankeranddieback，Cankerofpoplar 中文别名：生癌肠杆菌 杨树（细菌性）枯萎病菌的其他信息参见附录A。 3分类地位 杨树（细菌性）枯菱病菌属细菌域Bacteria，变形菌门Proteobacteria，-变形菌纲Gammaproteobac teria，肠杆菌目Enterobacteriales，肠杆菌科Enterobacteriaceae，肠杆菌属Enterobacter，生癌肠杆菌 Enterobacter cancerogenus 。 4 方法原理 杨树（细菌性）枯萎病菌主要通过带病的树干、树枝等传播，其症状特点、培养性状和生理生化特征、 PCR特异性鉴定结果是该病菌的鉴定依据。 C 仪器设备和试验用具 5.1仪器设备 PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Biolog仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱、超净工作台、高 压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、pH计、旋涡振荡器、微量可调加样器（2.5uL、 10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)等。 5.2试验用具 剪刀、灭菌解剖刀、手持放大镜、全钢大号指甲钳、玻璃棒、接种环、镊子、培养皿、酒精灯、三角烧瓶、 量筒、离心管、滤纸等。 1 GB/T36807—2018 6试剂和培养基 6.1试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂如各 种溶液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B、附录C的要求准备。商品化试剂参见其使用 说明。 （NaCI）、Tris饱和酚、三氯甲烷（CHCl）、异戊醇（C,Hi2O）、溴化乙锭（EB）、PCRPremix、DL2000DNA Marker、特异性引物、生理生化相关试剂。 6.2培养基 营养琼脂培养基（NA）。培养基配制方法及步骤见附录B。 7鉴定 SAC 7.1症状检查 逐一对抽样产品进行症状观察。仔细观察树皮、树枝是否有溃疡斑或者开裂现象（参见附录D图 D.1），树枝顶端是否产生坏死。该病菌可导致树皮开裂，树枝顶端坏死。病菌侵染后，茎周围产生比较 宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。感病品种在一定条件下产生的溃疡 斑更深并且呈纵向排列（图D.2）。疑似的病组织要带回实验室进行显微镜检查和病原菌分离。 7.2病原细菌的分离纯化 选取产生症状的树枝等病组织，用流水冲洗干净、晾干，剪成小段后用70%乙醇（或1%次氯酸钠） 表面消毒1min～2min，用无菌水冲洗3次，晾干后剪碎，于200uL无菌水中浸泡，并用灭菌解刀或 灭菌玻璃棒破碎组织，尽量使内部细菌释放出来。15min～20min后用接种环蘸取浸液，在营养琼脂 培养基（NA）上划线分离，平板在30℃下培养24h～48h后，挑取单菌落划线纯化备用。 7.3病原细菌的菌落及菌体形态观察 将纯化的菌株在营养琼脂培养基（NA）上划线培养，观察细菌在营养琼脂培养基上的生长及菌落 形态。显微镜下观察菌体大小和形态。 7.4生理生化特性测定 取可疑菌株，应用BIOLOG微生物全自动鉴定系统（GENⅢ）或细菌微量生化鉴定管对可疑菌株 进行相关生理生化指标测定。 7.5PCR特异性扩增检测 在上述检测和鉴定的基础上，通过杨树（细菌性）枯萎病菌PCR特异性扩增检测进一步确定和验 证，具体检测方法见附录C。 7.6测序 对PCR扩增结果为阳性的样品，需将PCR扩增产物进行测序，并与扩增靶标片段进行比对，以进 2 GB/T36807—2018 一步确证是否是杨树（细菌性)枯萎病菌。 8 结果判定 若经症状检查并分离的细菌菌株的培养性状与描述相符，生理生化鉴定结果与Enterobacter can cerogenus特征相符，且PCR检测结果为阳性，扩增片段经测序比对结果与靶标序列片段相符，则可以 判定为检出杨树（细菌性）枯萎病菌；否则判定为未检出。 9 样品及检测结果保存 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杨树（细菌性）枯菱病菌的样品应妥善保存，以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理， 9.2 2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为杨树（细菌性）枯萎病菌的菌株，应妥善保存。可采用甘油冷冻保存法 或冻干保存法保存。对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。 3 GB/T36807—2018 附录A （资料性附录） 杨树（细菌性）枯萎病菌其他信息 A.1地理分布 欧洲：波兰、捷克、斯洛伐克。 A.2寄主 寄主植物包括杨属（Populus）、桦木属（Betula）、云杉属（Picea）。据报道还可机会性侵染人体导 致伤口感染和败血病。 A.3症状 该病菌可导致坏死，引起树皮下组织显著生长，伴随着明显的树皮开裂，造成云杉等树枝顶端坏死 现象。侵染后茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝，从而导致树皮脱落。感病 品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且呈纵向排列。 A,4病原菌形态及培养性状 杨树（细菌性）枯萎病菌为革兰氏阴性菌，菌体直杆状，两端呈椭圆形，周生鞭毛，能游动，大小 (0.6μm~1.0μm）×（1.2μm~3.0μm）。不产生芽孢 在NA平板培养基30℃培养48h后，单个菌落呈圆形，表面平滑，呈灰白色，不透明，边缘完整。 将纯菌落穿刺接种于NA试管培养基，可沿穿刺线和培养基表面生长良好，偶有气体产生。 A.5病原菌生理生化特征 SAC 兼性厌氧，接触酶反应阳性，产酸产气，运动，柠檬酸和丙二酸反应阳性，能产生精氨酸双水解酶、鸟 氨酸脱羧酶和脱氧核糖核酸酶，Voges-Proskauer反应及明胶液化阳性，不产生赖氨酸脱羧酶、氧化酶、 淀粉酶，不能还原硝酸盐，甲基红和吲哚测试阴性 A.6杨树（细菌性）枯萎病菌与肠杆菌属其他相关种的表型特征区分 杨树（细菌性）枯萎病菌与肠杆菌属其他相关种的表型特征区分见表A,1。 4 GB/T368072018 表 A.1 杨树（细菌性）枯萎病菌与肠杆菌属其他相关植物致病种的表型特征区分 病原菌 溶解肠杆菌 杨树(细菌性) 超亚肠杆菌 测试项目 E.cloacae 桑肠杆菌 梨形肠杆菌 阴沟肠杆菌 阪崎肠杆菌 枯萎病菌 E.nimipress subsp. E.mori E.cloacae E.pyrinus E.sakazakii E.cancerogenus uralis dissolvens VP实验 Voges-Proskauer + + reaction MR实验 Methyl red test 鸟氨酸脱羧酶 Ornithine + decarboxylase 精氨酸双水解酶 Arginine dihydrolase 移动性 + Motility 七叶树素水解 十 Aesculin hydrolysis 赖氨酸脱羧酶 Lysinedecarboxylase 燕糖 + Sucrose 蜜二糖 Melibiose D-阿拉伯糖醇 D-Arabitol D-山梨醇 D-Sorbitol L-岩藻糖 + L-Fucose 丁二胺 + ND Putrescine 鼠李糖 十 + α-L-Rhamnose 5