ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36780—2018 辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Pepper mild mottle virus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36780—2018 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 病毒基本信息 原理 仪器、用具及试剂 5.1 仪器 5.2 用具 5.3 试剂 6取样 6.1 种子取样 6.2 生长期植株取样 检测鉴定 7 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 7.2 斑点酶联免疫吸附测定 7.3 胶体金免疫层析测定 7.4 RT-PCR检测 7.5 实时荧光RT-PCR检测 7.6 接种反应 8结果判定 样品保存与结果记录 9.1样品保存 9.2 结果记录 附录A（资料性附录） 辣椒轻斑驳病毒其他信息 附录B（规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 附录C（规范性附录） 斑点酶联免疫吸附测定 附录D（规范性附录) 胶体金免疫层析测定 附录E（规范性附录） RT-PCR检测 13 附录F（规范性附录） 实时荧光RT-PCR检测 15 附录G（资料性附录） 种子感染水平和取样量 附录H（资料性附录） 接种反应 17 参考文献 GB/T36780—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共 和国甘肃出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：魏梅生、郭京泽、朱水芳、孔君、李桂芬、赵文军、王军平、文朝慧、尤佳 GB/T36780—2018 辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了辣椒轻斑驳病毒（Peppermildmottleuirus）的检疫鉴定方法。 本标准适用于寄主植株和未处理种子上辣椒轻斑驳病毒的检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3病毒基本信息 3 学名：Pepper mild mottle virus 缩写：PMMoV 中文名：辣椒轻斑驳病毒 异名：烟草花叶病毒潜隐株系；烟草花叶病毒Samsun潜隐株系 分类地位：植物杆状病毒科（Virgaviridae），烟草花叶病毒属（Tobamovirus） PMMoV的其他信息参见附录A。 4 原理 PMMoV的蛋白和基因组特征是该病毒检测鉴定的依据。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （DAS-ELISA）、斑点酶联免疫吸附测定（Dot-ELISA）、胶体金免疫层析测定、RT-PCR、实时荧光 RT-PCR等方法来特异性检测该病毒，并判断样品是否带有PMMoV。 PMMoV的侵染性是该病毒生物学活性的重要指标。采用生物学接种的方法来判断病毒的活性。 5 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）。 高速冷冻离心机（最大转速15000r/min）。 小型瞬时离心机（最大转速7000r/min）。 普通冰箱（4℃）。 超低温冰箱（一80℃）。 制冰机（每日制冰能力为110kg）。 旋涡振荡器（最大转速2800r/min）。 磁力搅拌器（搅拌容量50mL~2000mL）。 1 GB/T36780—2018 高压灭菌锅（最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105℃135℃）。 pH计（量程0.00~14.00，精度±0.01）。 超净工作台（高效滤膜可除去99.99%以上的0.3um粒子）。 PCR仪（温度范围4℃~99℃，控温精度土0.25℃）。 微波炉（烧烤型）。 电泳仪（输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA）。 电泳槽（长度X宽度×高度为310mm×150mmX90mm）。 凝胶成像分析仪（光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、 机载图像捕捉软件、图像分析软件）。 酶标仪（波长范围340nm~850nm）。 5.2 2用具 酶联板。 可调移液器头。 离心管。 研钵、微型磨等。 5.3 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 DAS-ELISA试剂见附录B。 Dot-ELISA试剂见附录C。 胶体金免疫层析测定试剂见附录D。 RT-PCR检测试剂见附录E。 实时荧光RT-PCR检测试剂见附录F。 6取样 6.1种子取样 6.1.1防交叉污染 依据取样的大小，按种子的千粒重，取出小样的分量。取样时要避免交叉污染，保持设备、台面、容 器、手等的清洁。 6.1.2待测种子的取样 种子的取样和病害的感染水平有关，为确保种传病害检测到的概率为95%或99%，可根据病害的 感染水平或健康的容许水平来确定取样大小，具体可参见附录G。 为保证感染水平在0.1%以上的病种子检测到的概率为95%，辣椒种子的最少取样量为3000粒种 子，每个小样的量最多为250粒种子。可根据种子的千粒重来推算出所取样品的重量。 6.2 2生长期植株取样 在植物的生长前期或中期，从具有典型花叶或斑驳症状的植株上采集叶片。 2 GB/T367802018 7检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染PMMoV的植物组织作为阳性对照，样品提取 缓冲液作为空白对照；其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。 7.2斑点酶联免疫吸附测定 斑点酶联免疫吸附测定，见附录C。 7.3 3胶体金免疫层析测定 病叶中病毒的检测也可采用胶体金免疫层析测定，见附录D。 7.4RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录E。如采用商品化一步法试剂盒，则按照 试剂盒说明进行。 7.5实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录F。如采用商品化一 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.6接种反应 接种反应参见附录H。 8结果判定 样品检测流程及结果判定按下述原则进行： 酶联（或胶体金免疫层析)方法检测结果为阳性，同时RT-PCR（或实时荧光RT-PCR)的检测 结果为阳性，则判定样品携带PMMoV； 酶联（或胶体金免疫层析）方法检测结果为阴性，则判定样品不携带PMMoV。 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带PMMoV的样品应在适合的条件下保存以备复核。种子应干燥低温保存，活体的 病株在隔离温室中保存，其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80℃冰箱中。做好登记和标记工 作，保存期限至少1年。 9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图 3 GB/T36780—2018 附录A （资料性附录） 辣椒轻斑驳病毒其他信息 A.1寄主范围 自然寄主主要为辣椒属植物（Capsicumspp.）。番茄和光烟草（Nicotianaglauca）之外的多数茄科 植物易感染该病毒。PMMoV感染苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）和昆诺阿藜（C.quinoa）引起 局部褪绿斑，无系统感染。感染曼陀罗（Daturastramonium）、心叶烟（Nicotianaglutinosa）、白肋烟 （N.tabacumcv.WhiteBurley）、枯斑珊西烟（N.tabacumcv.Xanthi-nc）、林烟草（N.sylvestris）产生局部 坏死斑，无系统感染。感染Capsicumchacoense、C.praetermissum引起严重的顶部坏死 A,2危害症状 引起辣椒植株矮化，叶片轻微褪绿，果实变小、畸形、斑驳。有时果实上出现凹陷坏死区域。 A.3分布 美国、加拿大、墨西哥、丹麦、冰岛、英国、法国、比利时、希腊、意大利、荷兰、西班牙、捷克、匈牙利、保 加利亚、埃及、塞内加尔、赞比亚、埃塞俄比亚、南非、突尼斯、阿根廷、苏里南、巴西、委内瑞拉、安提瓜和 巴布达、巴巴多斯、海地、牙买加、蒙塞拉特岛、圣卢西亚、特立尼达和多巴哥、巴拿马、澳大利亚、新西兰、 土耳其、以色列、日本、韩国、中国。 A.4传播方式 病毒可通过种子和机械接种传播，介体不易传毒。病毒通过辣椒种子传播，病毒存在于种皮的外 部，基本上不侵染胚乳。种传率在22%29%，种子收获贮藏后种传率下降。病种子、植株病残体和带 病毒的土壤是病毒重要的侵染来源。幼苗在田间移栽的过程中，容易被感染 A.5粒体形态 病毒粒体直杆状，大小为312nm×12nm，粒体中央有明显轴心。病毒蛋白亚基螺旋排列，螺距为 2.3 nm。 A.6基因组 单分体基因组，正单链RNA，基因组RNA由6357个核苷酸组成。共有4个ORF，编码4个蛋 白，分别为126kDa、183kDa病毒复制酶、30kDa细胞间移动蛋白和17.5