ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36771—2018 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Tomato mosaic virus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36771—2018 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 病毒基本信息 原理 仪器、用具及试剂 5.1 仪器 5.2 用具 5.3 试剂 6取样 6.1 种子取样 6.2 生长期植株取样 检测鉴定 7 7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 7.2 斑点酶联免疫吸附测定 7.3 胶体金免疫层析测定 7.4 RT-PCR检测 7.5 实时荧光RT-PCR检测 7.6 接种反应 8结果判定 样品保存与结果记录 9.1样品保存 9.2结果记录 附录A（资料性附录） 番茄花叶病毒其他信息 附录B（规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 附录C（规范性附录） 斑点酶联免疫吸附测定 10 附录D（规范性附录） 胶体金免疫层析测定 12 附录E（规范性附录） RT-PCR检测 14 附录F（规范性附录） 实时荧光RT-PCR检测 16 附录G（资料性附录） 种子感染水平和取样量 17 附录H（资料性附录） 接种反应 18 参考文献 19 GB/T 36771—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共 和国甘肃出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：魏梅生、孔君、朱水芳、郭京泽、李桂芬、赵文军、王军平、文朝慧、尤佳 GB/T367712018 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了番茄花叶病毒（Tomatomosaicvirus）的检疫鉴定方法 本标准适用于寄主植株和未处理种子中番茄花叶病毒的检测鉴定 为降低种子的感染率，采用物理（如热处理）或化学方法处理（如酸处理、次氯酸钠、磷酸三钠等）的 种子，或采用农用化学品或生物制剂处理的种子，使用本标准时需通过分析、抽样或比较实验，来证明残 留的抑制物不会影响到实验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 病毒基本信息 学名：Tomato mosaic virus。 缩写：ToMV。 中文名：番茄花叶病毒。 异名：番茄病毒1号（Lycopersicumvirus1）。 分类地位：植物杆状病毒科（Virgaviridae），烟草花叶病毒属（Tobamovirus）。 ToMV的其他信息参见附录A。 4原理 ToMV的蛋白和基因组特征是该病毒检测鉴定的依据。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （DAS-ELISA）、斑点酶联免疫吸附测定（Dot-ELISA）、胶体金免疫层析测定、RT-PCR、实时荧光RT PCR等方法来特异性检测该病毒，并判断样品是否带有ToMV。 ToMV的侵染性是该病毒生物学活性的重要指标。采用生物学接种的方法来判断病毒的活性， 5仪器、用具及试剂 5 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）。 高速冷冻离心机（最大转速15000r/min）。 小型瞬时离心机（最大转速7000r/min）。 普通冰箱（4℃）。 超低温冰箱（一80℃）。 1 GB/T36771—2018 制冰机（每日制冰能力为110kg）。 旋涡振荡器（最大转速2800r/min）。 磁力搅拌器（搅拌容量50mL～2000mL）。 高压灭菌锅（最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105℃～135℃）。 pH计（量程0.00~14.00，精度0.01)。 超净工作台（高效滤膜可除去99.99%以上的0.3um粒子）。 PCR仪（温度范围4℃～99℃，控温精度士0.25℃）。 微波炉（烧烤型）。 电泳仪（输出电压5V~600V输出电流2mA~200mA）。 电泳槽（长度×宽度×高度为310mm×150mm×90mm）。 凝胶成像分析仪（光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、 机载图像捕捉软件、图像分析软件）。 酶标仪（波长范围340nm~850nm）。 5.2 2用具 酶联板。 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)。 可调移液器头。 离心管。 研钵、微型磨杆等。 5.3 3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 DAS-ELISA试剂见附录B。 Dot-ELISA试剂见附录 C。 胶体金免疫层析测定试剂见附录D。 RT-PCR检测试剂见附录E。 实时荧光RT-PCR检测试剂见附录F。 6取样 6.1种子取样 6.1.1 防交叉污染 依据取样的大小，按种子的千粒重，取出小样的分量。取样时要避免交叉污染，保持设备、台面、容 器、手等的清洁。 6.1.2待测种子的取样 种子的取样和病害的感染水平有关，为确保种传病害检测到的概率为95%或99%，可根据病害的 感染水平或健康的容许水平来确定取样大小，具体可参见附录G。 为保证感染水平在0.1%以上的病种子检测到的概率为95%，番茄种子的最少取样量为3000粒种 子，每个小样的量最多为250粒种子。可根据种子的千粒重来推算出所取样品的重量。 2 GB/T 36771—2018 6.2生长期植株取样 在植物的生长前期或中期，从具有典型花叶或斑驳症状的植株上采集叶片。 7检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染ToMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲 液作为空白对照；其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。 7.2 2斑点酶联免疫吸附测定 斑点酶联免疫吸附测定，见附录C。 7.3胶体金免疫层析测定 病叶中病毒的检测也可采用胶体金免疫层析测定，见附录D。 7.4RT-PCR检测 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录E。如采用商品化一步法试剂盒，则按照 试剂盒说明进行。 7.5实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录F。如采用商品化 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.6接种反应 接种反应参见附录H。 8 结果判定 样品检测流程及结果判定按下述原则进行： 酶联（或胶体金免疫层析）方法检测结果为阳性，同时RT-PCR（或实时荧光RT-PCR）的检测 结果为阳性，则判定样品携带ToMV。 一酶联（或胶体金免疫层析）方法检测结果为阴性，则判定样品不携带ToMV 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带ToMV的样品应在适合的条件下保存以备复核。种子应干燥低温保存，活体的病 株在隔离温室中保存，其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80℃冰箱中。做好登记和标记工作， 3 GB/T 36771—2018 保存期限至少1年。 9.2 结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图。 4