ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T15805.3—2018 代替GB/T15805.3—2008 病毒性出血性败血症诊断规程 Code of diagnosis for viral haemorrhagic septicaemia(VHS) 2019-02-01实施 2018-07-13发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15805.3—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T15805.3一2008《鱼类检疫方法第3部分：病毒性出血性败血症病毒 （VHSV）》。本标准与GB/T15805.3一2008相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： ——增加了采样； —增加了临床症状； -增加了间接免疫荧光抗体试验（indirectimmunofluorescentantibodytest，IFAT）检测病毒性 出血性败血症病毒抗原的方法； 增加了酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）检测病毒性出血性 败血症病毒抗原的方法； 增加了RT-PCR和荧光RT-PCR检测方法； 一增加了综合判定； 增加了VHS的规范性附录。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、山东出入境检验检疫局、深圳出入境检验检疫局、北京出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人：余卫忠、孙涛、尹伟力、贾鹏、吕永辉、谷强、张利峰、岳志芹、王津津、江育林。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T15805.1—1995; GB/T15805.3—2008。 1 GB/T15805.3—2018 病毒性出血性败血症诊断规程 1范围 本标准规定了病毒性出血性败血症临床症状、组织病理学特征、病毒分离、中和试验、间接荧光抗体 试验、酶联免疫吸附试验、逆转录聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应进行鉴定的方法。 本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 SC/T 7016.1鱼 鱼类细胞系第1部分：胖头鳞肌肉细胞系（FHM) SC/T7016.5 鱼类细胞系第5部分：鲤上皮瘤细胞系（EPC) SC/T 7016.9 鱼类细胞系第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系（BF-2） SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BF-2：蓝鳃太阳鱼细胞系（bluegillfrycellline) bp：碱基对（basepair) CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect） CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） Ct：循环阈值（cyclethreshold) cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementarydeoxyribonucleicacid) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EDTA乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid） EPC：鲤上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprinicellline) FBS:胎牛血清(fetal bovine serum) FHM：胖头肌肉细胞系（fatheadmonnowcellline） FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethy1)-1-piperazineethanesulfonic acid] OPD：邻苯二胺（o-phenylenediamine） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution） PBST：磷酸盐吐温缓冲液（phosphatebuffersolution-tween-2o) 1 GB/T15805.3—2018 PFU：空斑形成单位（plaqueformingunit） RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) TBE：三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液（Tris-Borate-EDTA） TCIDso：50%组织细胞感染量（50%tissuecultureinfectivedose) TMB：3,3,5,5'-四甲基联苯胺（3,3,5,5-Tetramethylbenzidine) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane] VHSV：病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicaemiavirus） 4试剂和材料 4.1水：应符合GB6682中一级水的规格，用于RT-PCR时要用DEPC处理，除去RNA酶。 4.2青霉素。 4.3链霉素。 4.4逆转录酶一20℃保存，避免温度剧烈变化 4.5I RNA酶抑制剂一20℃保存，避免温度剧烈变化。 4.6 dNTP：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各 10 mmol/L。 4.7 Taq酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 4.8 溴酚蓝。 VHSV参考株：由农业部相关部门提供。 4.10 鼠抗VHSV的单克隆抗体（包被用）：由农业部相关部门提供。 4.11 抗VHSV的参考血清：与包被用单抗不是来源于同一种动物，由农业部相关部门提供。 4.12 FITC标记的二抗：抗4.11中所指动物的抗体。 4.13 辣根过氧化物酶标记的二抗：抗4.11中所指动物抗体。 4.14 阴性对照：正常细胞组织悬液。 4.15 鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）、蓝鳃太阳鱼细胞（BF-2）、胖头肌肉细胞（FHM）应分别符合 SC/T7016.5,SC/T7016.9和SC/T7016.1的要求。 4.16细胞生长液：用含厄尔平衡盐（Earle'sbalanced salts）的M199培养基配置，另加10%胎牛血清 (FBS)。 4.17细胞维持液：用含厄尔平衡盐（Earlesbalancedsalts）的M199培养基配置，另加2%胎牛血清 (FBS)。 4.18 丙酮：分析纯。 4.19 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.20 0.01mol/LPBS:见附录A中的A.1。 4.21 固定液：见A.2。 4.22 PBST:见A.3。 4.23 包被稀释液：见A.4。 4.24 底物OPD溶液：见A.5。 4.25 CATB溶液：见A.6。 4.26 抽提液IⅡI：见A.7。 4.27 抽提液I见A.8。 4.28 1XRT缓冲液。 4.29 TBE缓冲液：见A.9。 2 GB/T 15805.3—2018 4.30DNA分子量标准。 4.315%脱脂奶。 4.32RT-PCR引物： F: 5'-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGTGAA-GCG-3', R: 5'-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3', 扩增N基因的505bp片段，序列参见附录B。 4.33荧光RT-PCR引物： F: 5'-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3', R: 5'-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3', 探针： 5'-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1-3'。 扩增N基因的532-608的片段，序列参见附录B。 5 5器材和设备 5.1 超净工作台。 5.2 生化培养箱。 5.3 荧光倒置显微镜。 5.4 冷冻离心机和离心管。 5.5 超低温冰箱和普通冰箱 5.6 细胞培养瓶及细胞培养板 5.7 高压灭菌锅。 5.8 磁力搅拌器。 5.9 真空高压过滤器。 5.10 组织研磨器。 5.11 PCR仪及荧光定量PCR仪。 5.12 微量移液器及吸头。 5.13 电泳仪。 5.14 小型离心机。 制冰机。 5.15 5.16 微波炉或电炉。 5.17 凝胶成像仪或紫外透射仪。 5.18 酶标仪。 5.19 剪刀，镊子。 5.20 天平。 临床症状和组织病理学特征 参见附录C。 7 采样 7.1采样对象 鲑、鳟等易感鱼类。 3 GB/T15805.3—2018 7.2采样水温与数量 应在水温低于18℃进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行。成熟雌鱼需取卵巢液，鱼卵则取卵膜。体长小于4cm的鱼苗取整 条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊：体长4cm6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则 取肾、脾、心和脑组织。 8病毒分离 8.1样品处理 VHSV的分离，每5尾鱼为1个样品，若有症状