ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T18869—2019 代替GB/T18869—2002 饲料中大肠菌群的测定 Determination of coliformsinfeeds 2020-01-01实施 2019-06-04发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 18869—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T18869—2002《饲料中大肠菌群的测定》。 本标准与GB/T18869一2002相比，主要技术内容修改如下： 修改了适用范围（见第1章，2002年版的第1章）； 一增加了术语和定义（见第3章）； 一修改了原理的描述（见第4章，2002年版的第3章）； 一增加了LST发酵法（见8.3）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 （北京）。 本标准主要起草人：李丽蓓、刘晓露、李胜、王彤、 本标准的历次版本发布情况为： GB/T188692002。 1 GB/T 18869—2019 饲料中大肠菌群的测定 1范围 本标准规定了饲料中大肠菌群的测定方法。 本标准适用于饲料和饲料添加剂中大肠菌群的测定。 S2C 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T 6682 2分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列定义适用于本文件。 3.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2 最可能数 文mostprobablenumber;MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4原理 将待测样品稀释至适当浓度并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计 学概率论推算表，查出待测样品中大肠菌群的最大可能数 培养基或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 5.1水：符合GB/T6682中三级水的要求。 5.2 乳糖胆盐发酵培养基：见附录A中A.1。 5.3 伊红美蓝琼脂：见附录A中A.2。 5.4 乳糖发酵培养基：见附录A中A.3。 5.5 革兰氏染色液：见附录A中A.4。 5.6 月桂基硫酸盐胰蛋白陈（laurylsulfatetryptose，LST）肉汤：见附录A中A.5。 5.7 煌绿乳糖胆盐（brilliantgreenlactosebile，BGLB)肉汤：见附录A中A.6。 5.8 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.7。 5.9 无菌生理盐水：见附录A中A.8。 1 GB/T18869—2019 5.10 氢氧化钠溶液：c(NaOH)=1mol/L。见附录A中A,9。 5.11 盐酸溶液：c(HCI)=1mol/L。见附录A中A.10。 6 仪器设备 6.1 天平：感量0.1g。 6.2恒温培养箱：36℃±1℃。 6.3无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 6.4无菌锥形瓶：容量500mL。 6.5均质器。 6.6振荡器。 6.7显微镜：普通生物显微镜。 6.8 pH计或精密pH试纸。 7样品 7.1采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来 污染。 7.2采样方法 7.2.1应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于 500 g(mL)。 7.2.2独立包装小于、等于500g的固态产品或小于，等于500mL的液态产品，取完整包装。 7.2.3独立包装天于500mL的液态产品·应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集 适量样品，放人同一个无菌采样容器内作为一件样品。 7.2.4独立包装大于500g的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放 入同一个无菌采样容器内作为一件样品。 7.3采集样品的贮存和运输 7.3.1应尽快将样品送往实验室检验。 7.3.2应在运输过程中保持样品完整 7.3.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化 8试验方法 8.1试验方法类别 本标准试验方法分为乳糖胆盐发酵法和LST发酵法，乳糖胆盐发酵法适用于限量要求以 MPN/100g(mL)为单位的产品，LST发酵法适用于限量要求以MPN/g(mL）为单位的产品。 8.2乳糖胆盐发酵法 8.2.1试样的稀释 8.2.1.1 固态和半固态样品：称取25g试样，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质 2 GB/T18869—2019 杯，8000r/min10000r/min均质1min～2min，或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成10倍稀释的样品匀液 注：含有硬物的原料，如肉骨粉等里面含骨渣易扎破均质袋，不宜用拍击式均质器。 8.2.1.2液态样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥 形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，置于振荡器中振荡，充分混匀，制成10倍稀 释的样品匀液 注：黏稠样品宜采用固态称量法。 8.2.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取10倍稀释的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成100倍稀释的样品匀液。 8.2.1.4根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 一次，换一只1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样液接种完毕，全过程不超过15min。 8.2.2乳糖发酵试验 箱内，培养24h土2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则 按8.2.3和8.2.4程序进行操作。 8.2.3分离培养 取出，观察菌落形态，并做确证试验。 8.2.4确证试验 在上述平板上，挑取可疑菌落1个～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36℃土1℃培 养箱内，培养24h士2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大 肠菌群为阳性。 8.2.5试验程序图 乳糖胆盐发酵法试验程序图见附录B。 8.3LST发酵法 8.3.1试样的稀释 操作同8.2.1。 8.3.2初发酵试验 LST肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃土1℃培养24h土2h，观察 产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 8.3.3复发酵试验（证实试验） 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于BGLB管中，36℃土1℃C培养48h士2h， 3