ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38096—2019 微生物源抗生素类次生代谢产物 杀线虫活性测定 浸虫法 Determination of nematicidal activity for microbial antibiotic secondarymetabolitesImmersion method 2019-10-18实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T38096—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院。 本标准主要起草人：许益鹏、叶子弘、俞晓平、马爱进、崔海峰、张雅芬、申屠旭萍、张蓬军、杨倩倩 1 GB/T38096—2019 微生物源抗生素类次生代谢产物 杀线虫活性测定浸虫法 1范围 本标准规定了用浸虫法测定微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性的方法。 本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 microbial antibiotic secondary metabolites 微生物源抗生素类次生代谢产物 微生物次生代谢产生的具有抗生素活性特征的物质， 3.2 致死中浓度 lethal concentration50%;LC50 使受试线虫半数死亡的微生物源抗生素类次生代谢产物的浓度。 4原理 将线虫浸入微生物源抗生素类次生代谢产物药剂中使线虫死亡，用中性红将线虫死细胞或组织染 成在显微镜下可见的红色，通过染色情况判断次生代谢产物对线虫的致死情况，计算线虫的校正死亡 率，根据校正死亡率的几率值和药剂浓度对数的线性回归关系得到回归曲线，计算得到LC50，从而测定 微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫的活性。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1水：GB/T6682,二级水。 5.25mg/mL胆固醇溶液： 称取适量胆固醇，溶于相应体积的无水乙醇中，配成5mg/mL的胆固醇溶液，0.22uμm孔径的微孔 滤膜过滤除菌 5.31mol/L氯化钙溶液： 称取适量氯化钙，溶于相应体积的水中，配成1mol/L的氯化钙溶液，0.22um孔径的滤膜过滤 1 GB/T38096—2019 除菌。 5.41mol/L硫酸镁溶液： 称取适量七水合硫酸镁，溶于相应体积的水中，配成1mol/L的硫酸镁溶液，0.22μm孔径的微孔 滤膜过滤除菌。 5.51mol/L磷酸钾缓冲液： 称取118.1g磷酸二氢钾，23.0g磷酸氢二钾，溶解于900mL的水中，调节pH值至6.0，再加水定 容到1L，0.22um孔径的微孔滤膜过滤除菌。 5.6线虫专用缓冲液（M9缓冲液）： 取3.0g磷酸二氢钾，6.0g磷酸氢二钠，5.0g氯化钠，1mL浓度为1mol/L的七水硫酸镁，用水溶 解，并定容到1L，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌。 5.7次氯酸钠裂解液： 取0.1g氢氧化钠，溶于3.5mL水中，再加人1mL含有效氯10%~15%的次氯酸钠溶液混合。 5.8LB培养基： 20 min。 5.9 线虫生长固体培养基（nematodegrowthmedia，NGM）： 称取2.5g胰蛋白，3.0g氯化钠，17.0g琼脂粉，用975mL水溶解，121℃灭菌20min，冷却到 55℃左右时，加人1mL浓度为5mg/mL的胆固醇溶液，1mL浓度为1mol/L的氯化钙溶液，1mL 浓度为1mol/L的硫酸镁溶液，25mL浓度为1mol/L的磷酸钾缓冲液。 5.10生理盐水： 取0.9g氯化钠，溶解于100mL水中，配成生理盐水，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤。 5.111g/L中性红溶液： 称取适量中性红粉末溶于相应体积的生理盐水中，配成1g/L的中性红溶液，0.22μm孔径的微孔 滤膜过滤。 5.120.1%（体积分数）吐温80： 取100μL吐温80，溶解于100mL水中。 5.13N2野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans,theBristol strainN2)。 5.14尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50（EscherichiacoliOP50）。 6仪器设备 6.1电子天平：感量为0.1g。 6.2微孔滤膜：孔径为0.22μum。 6.3恒温摇床：温度偏差在土1℃以内。 6.4恒温培养箱：温度偏差在士1℃以内。 6.5显微镜：放大倍数100倍以上。 7测定步骤 7.1大肠杆菌0P50的培养与接种 体培养基上，室温放置约30min。 2 GB/T38096—2019 7.2N2野生型秀丽隐杆线虫的培养与同步化 将N2野生型秀丽隐杆线虫接入含有大肠杆菌OP50的NGM固体培养基上，于20℃恒温培养箱 中培养3d,用M9缓冲液冲洗NGM固体培养基，收集处于产卵期的线虫。用微量移液器吸取1mL含 产卵期线虫的M9缓冲液至10mL离心管中，向离心管中加入4.5mL次氯酸钠裂解液，上下颠倒混合 约5min，用2000r/min的转速离心5min，弃上清液收集虫卵，用M9缓冲液重复洗涤和离心3次后， 用0.2mL无菌M9缓冲液悬浮虫卵，将卵液转移到含大肠杆菌OP50的NGM固体培养基上，于 20℃恒温培养箱中培养48h，线虫成长至四龄幼虫（L4）。 7.3药剂活性测定 7.3.1试虫准备 用无菌M9缓冲液将L4期线虫从NGM固体培养基上冲洗下来，2000r/min离心5min，弃上清 液收集虫体，用M9缓冲液重复洗涤和离心2次，最后用无菌M9缓冲液重悬线虫至浓度约100头/mL 备用。 7.3.2药剂配制 水溶性药剂直接用水溶解、稀释。非水溶性药剂先用合适的有机溶剂（如：二甲基亚砜、乙醇、丙酮 比或等差的方法设置5个以上系列的质量浓度，每个质量浓度药液量不少于10mL。 7.3.3药剂处理 用微量移液器分别吸取不同浓度的药剂溶液各2mL，加人不同的5mL试管中，每个试管另加入 1mL含大肠杆菌OP50的M9缓冲液悬液，再加入1mL线虫悬液，之后将试管置于20℃恒温培养箱 中培养24h。每个浓度的药剂处理各设置3次重复。 7.3.4空白对照处理 以不含药剂的溶液作为空白对照液。取3个5mL试管，在每个试管中依次加入2mL空白对照 液、1mL含大肠杆菌OP50的M9缓冲液悬液、1mL线虫悬液，之后将试管置于20℃恒温培养箱中培 养24h。 7.3.5线虫染色与死亡线虫记录 药剂处理和空白对照处理后，将试管置于离心机中，20o0r/min离心5min，弃上清液收集虫体，用 M9缓冲液重复洗涤和离心2次。加人100μL的1g/L中性红溶液进行染色，染色5min后，2000r/min 离心5min，弃上清液，加入100μLM9缓冲液悬浮线虫，并转移至96孔板中。虫体一半以上染为红色 的线虫判定为死亡线虫。在显微镜下观察线虫死亡情况，记录每个处理后观察到的线虫总数和死亡线 虫数。 8结果分析 8.1 死亡率计算 死亡率按式(1)计算： K X 100 :(1) 5ZK