ICS 07.080 A 20 中华人民共和国国家标准 GB/T 38137—2019 核酸适配体体外筛选技术导则 Guidelines for in vitro screening of nucleic acid aptamers 2019-10-18实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 38137—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：河北省食品检验研究院、中国标准化研究院、中国科技大学、合肥工业大学、河北 农业大学、西南大学、江南大学、河南大学、浙江工商大学、北京食品科学研究院、河北医科大学。 本标准主要起草人：罗昭锋、周巍、马爱进、张岩、翟昊、郑磊、王向红、陈佳、王周平、陈伟、马良 田益玲、张翠侠、李永波、李永艳、康文艺、王彦波、傅凌琳、孙勇、吕品。 GB/T 38137—2019 核酸适配体体外筛选技术导则 1范围 本标准规定了核酸适配体体外筛选的筛选流程、筛选进程监测、测序和序列分析、候选适配体的鉴 定与优化、防污染措施。 本标准适用于金属离子、小分子、大分子、细胞及颗粒物、组织以及混合目标物等不同层次目标物体 系的核酸适配体筛选 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核酸适配体 nucleicacidaptamer 能够与特定目标物发生高亲和性和特异性结合的寡核苷酸片段。 注：目标物可以为金属离子、小分子、大分子、细胞、组织以及混合靶标等。核酸适配体折叠成特定三维结构，通过 空间构型互补与目标物高亲和性高特异性结合，以短的单链核苷酸序列（单链DNA或RNA)为主。 3.2 体外筛选技术 in vitro screeningtechnique 通过目标物与大容量随机寡核苷酸文库作用，将所形成的目标物-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸 分离，再利用PCR体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增，多次重复以上筛选步骤最终获得 与目标物有特异结合作用的核酸适配体的技术。 4 缩略语 SAC 下列缩略语适用于本文件。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis）； PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）； polyA：多聚腺苷酸（polyadenylation)； SELEX：指数富集的配体系统进化（exponentiallyenrichedligandsystemevolution）。 5 筛选流程 5.1 筛选基本途径 SELEX技术的基本途径是将大容量的随机寡核苷酸序列库（10131015个随机寡核苷酸序列）与靶 1 GB/T38137—2019 分子共同孵育，并通过各种分离途径将结合复合物与未结合序列分离。洗脱获得与靶分子结合的序列 并对这些序列进行聚合酶链式反应扩增生成次级文库，用于下轮筛选，如此数轮反复后，对于得到有亲 和力的筛选文库，挑选出富集的单克隆适配体并进行测序，获得特异性识别靶分子的寡核苷酸序列，即 寡核苷酸适配体。大容量的分子文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，理论上能针对任何靶分子筛选 得到其特异性的适配体序列。 5.2初始文库 5.2.1DNA初始文库 DNA初始文库通过化学合成获得，用于核酸适配体筛选的初始文库含有固定序列区域与随机序列 区域。碱基包含天然碱基和非天然碱基，两端为固定引物区域，中间为随机序列区域。固定引物区域的 设计应遵循PCR引物的设计规则。DNA文库的理论库容量由中间随机区域的长度决定。中间随机区 域的长度在20bp～50bp，其中30bp～40bp使用最多。每个靶标第一轮筛选需要约1OD(吸光度）的 5.2.2RNA初始文库 RNA由DNA初始文库反转录获得。DNA初始文库在5端带有T7启动子识别序列。 5.3分离方法 5.3.1概述 分离是目标物-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离的过程。常用的分离方法包括：磁分离、亲和 层析、微流控、毛细管电泳、流式细胞术、硝酸纤维素膜过滤、离心、超滤等。 5.3.2正筛选 5.3.2.1金属离子 金属离子采用固定文库的方法进行核酸适配体的筛选。与金属离子有亲和力的核酸序列由于竞争 从固相解离，实现结合与不结合的文库分子的分离。与金属离子有亲和力的核酸序列发生荧光信号的 变化，通过流式细胞术分选等方法实现分离。 5.3.2.2小分子 小分子的核酸适配体筛选应选择固定小分子或固定核酸文库的方法进行分离。固定小分子的筛选 方法将小分子偶联在固相介质上，与小分子有亲和力的核酸结合在该固相介质上，通过洗脱获得与小分 子结合的富集文库。固定核酸文库的分离方法同5.3.2.1。 5.3.2.3大分子 大分子指相对分子质量超过5000Da的分子。大分子分离方法除5.3.2.2所述方法外，还能通过 胶阻滞电泳、毛细管电泳、超滤、膜过滤、离心等将目标物-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离开来。 5.3.2.4细胞及颗粒物 细胞的核酸适配体筛选应使用悬浮细胞或贴壁细胞。使用悬浮细胞或细菌时，通过离心法或流式 细胞术分选等方法实现分离；使用贴壁细胞时，在培养皿或培养瓶中进行孵育及清洗，吸弃上清，保留细 胞实现分离。病毒、细胞器较小的颗粒物核酸适配体筛选还可利用超滤、超速离心等方法实现分离。 2 GB/T38137—2019 5.3.2.5组织 组织切片的核酸适配体筛选，应将组织切片直接与文库孵育和清洗，实现结合与未结合的核酸序列 的分离。 5.3.2.6混合目标物 血清样本、细胞裂解液、体液等混合目标物的核酸适配体筛选可采用凝胶阻滞电泳分离、磁性分离 等方法。 5.3.3反筛选 分离方法同5.3.2，仅将目标物换为潜在干扰物，或空白基质（固相介质或背景基质）。细胞筛选时， 可选择相近的细胞系进行反筛选；采用病人血清进行筛选时可采用正常人血清进行反筛选。 5.4清洗与洗脱 通过清洗移除结合较弱的核酸序列，洗脱收集与目标物结合的寡核苷酸序列，用作下一轮筛选的文 库模板。用筛选缓冲液进行清洗，清洗强度应随筛选的轮数增加而逐步加强，如清洗次数、体积、温度、 时间等。洗脱使用加热、改变pH、改变盐离子浓度、使用变性剂、或通过酶解等方法实现。洗脱条件尽 量适用于后续PCR扩增条件。 5.5扩增 对洗脱得到的核酸序列进行PCR扩增以得到次级文库。RNA文库应先反转录为DNA文库后， 再进行扩增和体外转录。PCR包括常规PCR、荧光定量PCR、乳浊液PCR等。 5.6次级文库 SAG 5.6.1概述 DNA次级文库是经过筛选富集后得到的核酸序列经过PCR扩增后，制备获得的单链DNA分子 文库。RNA次级文库是经过筛选富集后得到的核酸序列反转录后经过PCR扩增，制备获得的单链 RNA分子文库。次级文库制备方法包括微球法、核酸酶降解法、长短链法、不对称PCR法。次级文库 应进行定量及纯度检验。 5.6.2微球法 微球法制备单链时，使用5端带生物素修饰的下游引物进行PCR扩增。利用生物素-链霉亲和素 之间特异性的相互作用，PCR产物结合到链霉亲和素磁珠上，改变洗脱缓冲液的pH，双链DNA变性解 链，带有生物素的反义链留在磁珠上，正义链解离，中和后即可获得次级文库。 5.6.3核酸酶降解法 使用入核酸外切酶切除5端带磷酸化修饰的DNA链，保留所需的正义链。经乙醇沉淀回收即可获得 次级文库。 5.6.4长短链法 使用长短链法制备单链时，使用3端带加长修饰（如polyA修饰）的下游引物进行PCR扩增。回收 3