ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38163—2019 常见过敏蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of allergenic proteinLC-MS/MS method 2019-10-18实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 38163—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中 心、辽宁出人境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：陈颖、古淑青、邓晓军、张九凯、郑秋月、王娉、黄文胜、韩建勋。 GB/T38163—2019 常见过敏蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了固态食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、否仁和核桃过敏蛋白的液相色谱-串联质谱 检测方法。 本标准适用于含小麦粉、燕麦粉、腰果、可可粉等固态食品基质中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁 和核桃过敏蛋白的液相色谱-串联质谱测定和确证。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 特征肽characteristic peptide 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶消化产物中发现、其氨基酸序列具有专属性的多肽。 3.1.2 食物过敏food allergy 免疫机制介导的食物免疫反应不良反应，即食物蛋白引起的异常或过强的免疫反应 注：免疫反应可由IgE或非IgE介导。表现为一疾病群，症状累及皮肤，呼吸、消化、心血管等系统 3.1.3 过敏原allergen 能够引起机体免疫系统异常反应的成分。 3.1.4 过敏蛋白 allergenprotein 能够引起机体免疫系统异常反应的成分中的蛋白质。 3.1.5 肽 peptide 两个或两个以上的氨基酸脱水缩合形成的有机化合物。 3.1.6 胰蛋白酶 trypsin 从动物胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，特 1 GB/T38163—2019 异性较强。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DTT：二硫苏糖醇（dithiothreitol) IAA：碘代乙酰胺（iodoacetamide) LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry） MRM：多反应监测（multiplereactionmonitoring） Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane] 4原理 利用质谱技术结合蛋白质组学软件挖掘能够鉴别区分自标食品过敏原特征肽段。通过构建的特征 肽段的质谱信息，对被测样品蛋白酶解后的多肽混合物进行定向监测，实现对食品过敏原的定性检测。 质谱中特征肽段的响应峰面积与过敏原的含量呈线性关系，将质谱响应峰面积与过敏原含量建立标准 曲线，以肽段的谱峰面积代表过敏原的实际量，通过标准曲线计算得到被测食品过敏原含量。 5主要试剂 除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 5.1碳酸氢铵（NH,HCO:）。 5.2二硫苏糖醇(CH1oO,S2,DTT)。 5.3碘代乙酰胺（ICH,CONH²,IAA）。 5.4三羟甲基氨基甲烷（C,HirNO3,Tris）。 5.5盐酸。 5.6磷酸。 5.72 乙酸(CH,COOH)：色谱纯。 5.8 甲酸（HCOOH)：色谱纯。 5.9 乙睛(CH,CN)：色谱纯 5.10 碳酸氢铵溶液（500mmol/L）：称取3.95g碳酸氢铵，用水溶解后定容至100mL。 5.11 碳酸氢铵溶液（50mmol/L）：称取3.95g碳酸氢铵，用水溶解后定容至1000mL。 5.12二硫苏糖醇（500mmol/L）：称取0.771g二硫苏糖醇，用500mmol/L碳酸氢铵溶液溶解后定容 至10mL。4℃冷藏可保存一个月。 5.13碘代乙酰胺溶液（500mmol/L）：称取0.925g碘代乙酰胺，用500mmol/L碳酸氢铵溶液溶解后 定容至10mL。4℃避光冷藏保存一个月。 5.14Tris-HCl溶液（40mmol/L）：称取2.42gTris，溶解于800mL水中，用10%盐酸调节pH至 8.0±0.1，用水定容至1000mL。 5.15考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%的磷 酸，用蒸馏水补充至200mL。 5.16甲酸的水溶液（0.1%，体积分数）：准确移取1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。 5.17甲酸的乙睛溶液（0.1%，体积分数）：准确移取1.0mL甲酸，用乙睛定容至1000mlL。 溶液于一20℃可保存6个月。 2 GB/T38163—2019 6 主要仪器设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子（ESI)源的三重四级杆质谱仪。 6.2 分析天平：感量为0.01g、0.001g、0.1g。 恒温水浴锅。 离心机：转速不低于2683g。 超滤离心管（10kD截止膜）。 6.6 注射器和0.22μm水系滤膜（聚醚滤膜）。 6.7 涡旋混勾仪。 6.81 pH计：测量精度为0.01。 6.9 微量移液器：0.5μL10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，200μL~1000μL 6.10 组织研磨器。 6.11 具塞离心管。 6.12 旋转蒸发仪。 6.13 分光光度计。 7.1 试样制备 7.1 标准工作液制备 7.1.1过敏原标准品：榛子、核桃、杏仁、大豆、花生、全脂奶粉和全蛋粉，或等效商业化标准品。 7.1.2食品基质标准品：小麦粉（饼干基质）、腰果（坚果基质）、燕麦粉（早餐谷物基质）、可可粉（巧克力 基质）（以上基质均无7.1.1中提到的7种过敏原），或等效商业化标准品。 7.1.3样品制备：称取每种过敏原标准品和食品基质标准品500g士0.1g，采用粉碎机粉碎后，再将其 研磨成细粉状，过50目筛，装入洁净盛样容器内，密封并标明标记，备用。 7.1.4标准储备液：分别准确称取1g（土0.005g）（精确至0.001g）过敏原标准品和食品基质（7种过敏 原分别配制4种基质），充分混匀后加入Tris-HCI溶液，定容至20mL。震荡均匀使试样完全溶解，置 于水浴锅60℃加热振荡提取3h。提取液以13800g高速离心5min，上清液过低蛋白质吸附的 0.05g/mL以上视为有效提取，储备液置于一20℃冰箱内保存备用。 7.1.5系列标准溶液：准确移取适量的标准储备液，用含不同基质的Tris-HCI溶液配制成最终浓度为 含全脂奶粉总蛋白0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L（相当于过敏 榛子、杏仁、大豆、鸡蛋、核桃总蛋白0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、20mg/L、80mg/L、160mg/L （相当于过敏原质量分数5mg/kg.10mg/kg、20mg/kg40mg/kg、200mg/kg、800mg/kg、1600mg/ kg）的系列标准工作溶液。 7.2试样保存 试样与蛋白提取液均在一20℃冰箱保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留 物含量的变化 3