ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T251652010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Protocol of identification of bovine,caprine,ovine and porcine derived materials in gelatin-Real time PCR method 2010-09-26发布 2011-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25165—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。 1 GB/T25165—2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。 该方法的检出限为0.1%。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB6783食品添加剂明胶 GB/T14699.1饲料采样 GB/T27403—2008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3. 2 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4原理 利用实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂 解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行内参照基 因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、 羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实 现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。 5检测用引物和探针 内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1。 1 GB/T25165—2010 表1 检测用引物和探针 名称 序 列 目的基因 内参照5端引物 5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3' 真核生物 内参照3'端引物 5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3' 18SrRNA基因 内参照探针 5'-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3' 牛5端引物 5'-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3' 牛3'端引物 5'-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3' 生长激素基因 牛探针 5'-(FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3' 羊5'端引物 5'-ACACAACTTCTACCACAACCC-3' 线粒体细胞色 羊3°端引物 5'-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3" 素b基因 羊探针 5'-(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3 猪5端引物 5′-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3' 猪3'端引物 5'-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3' 脱蛋白基因 猪探针 5'-(FAM)-CACCGTCAAGCAGC-(NFQ)(MGB)-3' 6试剂 苯酚（Tris饱和酚，pH8.0）、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70%乙醇 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。 7配制溶液 7.1裂解液 成分包括：2%（质量浓度）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵）， 1oommol/LTris（trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷），1.4mol/LNaCl, 20mmol/LEDTA（ethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸），用HCI调至pH8.0。 7.2实时荧光PCR反应混合液 12.5μL反应体系包括：1U～2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L～ 4.0 mmol/L的 Mg2+、0. 2 U～1 U 的 UNG 酶、0. 2 mmol/L 的 d(A,C,G)TPs、0. 2 mmol/L~ 0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。 8仪器设备 8.1 实时荧光PCR仪。 8.2 恒温水浴锅。 8.3离心机：离心力不小于3000g。 8.4 8.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 8. 6 pH计。 天平：感量0.01g。 8.7 样品采集 9 按照GB6783对食用明胶采样，按照GB/T14699.1对饲料明胶采样，将实验样品粉碎，充分混合 均匀后待用。 2 GB/T 25165—2010 10检验步骤 10.1DNA提取 称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mL裂解液，室温过夜后置于65℃恒温箱中温育 1h～2h，取出后迅速加人与裂解液等体积的室温酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1)（注意：如果样品因 温度下降凝固而无法获得上清，可将样品再次放入65℃恒温箱中使其重新液化），颠倒混，室温下 12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加人等体积的三氯甲烷-异戊醇（24：1），颠倒 混匀，室温下12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的离心管中，加人0.8倍异丙醇或2倍体积的 预冷无水乙醇混匀，一20℃放置0.5h~1h，4℃下12000g离心10min～15min，弃上清，用70%乙醇 洗涤沉淀一次，4℃下12000g离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50μL双蒸水，溶解沉淀， 一20℃保存。 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照，并置于每个提取系列中的最后。 10.2实时荧光PCR扩增 反应体系的体积为25μL，体系组成见表2。 表2实时荧光PCR检测反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 加人PCR反应体系的体积/μL 12.5 反应混合液 5'端引物 10 μmol/L 1 3'端引物 10 μmol/L 1 探针 10 μmol/L 1 模板 5 双蒸水 补足至总体积为25 实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃ 1min45个循环。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和提取空白对照。用分别含牛、羊、猪成分的样品作阳性对 照，用不含牛、羊、猪成分的样品作阴性对照。 样品设3个重复，对照设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。 11 结果判定 11.1PCR有效性判定 空白对照：无FAM荧光信号，相应Ct值>40.0。 阴性对照：无FAM荧光信号，相应Ct值>40.0。 阳性对照：有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤36.0。 否则判定为PCR无效。 11.2DNA提取有效性判定 在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有FAM荧光信号检出 且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤40.0。 否则DNA提取无效，应重新提取DNA，直至Ct值≤40.0。 11.3检测结果判定 在符合11.1和11.2的情况下，使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测：