ICS 65.150 B 50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25877—2010 淀粉胶电泳同工酶分析 Starch gel electrophoresis isozyme analysis 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 25877—2010 前言 本标准的附录A、附录B、附录 C、附录D和附录E均为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国海洋大学、黄海水产研究所。 本标准主要起草人：高天翔、张岩、韩志强、肖永双、张辉。 1 GB/T258772010 淀粉胶电泳同工酶分析 1范围 本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料、仪器、抽样、分析步骤及结果判定。 本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T18654.1一2008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则 GB/T18654.22008养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 3原理 利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同， 经催化、染色、扫描，获得各同工酶谱带、数目及吸收强度等，经比较分析，判定鱼类的遗传特性。 4试剂和材料 除另有说明外，所有试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.1水解马铃薯淀粉。 4.2柠檬酸。 4.3乳酸。 4. 4 乙二胺四乙酸。 4.5 乙二胺四乙酸二钠。 4.6 苹果酸。 4.7 乳酸锂。 4.8 磷酸氢二钠。 4. 9 磷酸二氢钠。 4.10 辅酶I。 4.11 辅酶IⅡI。 4.12 吩嗪甲酯硫酸盐。 4.13 氯化硝基四氮唑蓝。 4. 14 异柠檬酸三钠。 4.15 6-磷酸葡萄糖酸钠。 4.16 乙醇。 4.17丙酮。 4.18 3α-萘乙酸。 4.19 α-磷酸甘油。 4.20 6-磷酸葡萄糖。 4.21 山梨糖醇。 1 GB/T 25877—2010 固蓝RR盐。 4.22 4.23 冰乙酸。 4.24 盐酸。 4.25 氢氧化钠。 4.26 肝素。 4.27 氯化镁。 4.28 3-氨甲基-吗啡啉。 4.29 TC-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。 4.30 TC-8.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。 4.31 CAPM-6.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。 4.32 CAPM-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A。 4.33 TC-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。 4.34 TC-8.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。 4.35 CAPM-6.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。 4.36 CAPM-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B。 4.37 淀粉凝胶：配制方法见附录C。 4.38 染色缓冲液：配制方法见附录D。 4.39 染色液：几种常见同工酶染色液配制方法见附录E。 5仪器 5.1 微量匀浆机。 5.2 高速冷冻离心机（转速12000r/min）。 5.3 多用电泳仪。 5. 4 真空抽气机（泵）。 5.5 电炉或微波炉。 5.6 割胶器。 5.7 多层滤纸。 5.8 激光扫描仪。 5.9 pH计：精度为0.01。 5.10 制胶模具。 5. 11 染色盒。 5.12 4℃冷藏冰箱。 5.13 低温冰箱：冰室温度在一20℃以下。 5.14 恒温培养箱。 5.15 分析天平：精度为0.0001g。 5.16电子天平：精度为0.1g。 5.17 摄影装置：数码照相机。 6 抽样 6.1样品的抽样 按GB/T18654.2—2008的规定执行。 6.2 取样 取样品组织1g～2g试样，于低温冰箱中（一25℃以下）保存；对于血液试样，加肝素抗凝，于4℃ 2 GB/T 25877—2010 冰箱中保存，备用。 7分析步骤 7.1分析样品的制备 电泳前取0.3g左右样品放人1.5mL离心管，加入等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨， 研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12000r/min的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保 存备电泳用。 对于血液试样，待分离出血清后上样。 7.2凝胶制备 凝胶制备见附录C。 7.3电泳步骤 用手术刀在凝胶距离边缘三分之一（约2.5cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取7.1制备的样品 提取液（或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁）插人切口中。上样完毕后，向电泳槽内加入电 7.4染色、固定 电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒 入染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。待显色充分后，用7%的冰乙酸溶液终止反应 各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E。 7.5制干胶片 取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后编号保存。 7.6摄影、扫描 用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描。 7.7结果分析 7.7.1酶位点与等位基因分析 根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位 点的等位基因频率。 7.7.2群体遗传特异性 多态位点比例（P）、平均杂合度观察值（H。）、平均杂合度期望值（H。)分别按式（1)、式（2)和式（3） 计算： P= N1/n X 100% ..(1) 式中： P—一多态位点比例； N——多态位点数； n—检测位点总数。 H。= (2) 式中： H。——平均杂合度观察值； 第i个位点上第i个等位基因的纯合基因型的频率； 第i个位点上的等位基因总数； 检测位点总数。 3