ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25887—2010 奶牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP 法 Method of PCR-RFLP for detecting complex vertebral malformation in dairy cattle 2011-01-10发布 2011-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 25887—2010 前言 本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军。 1 GB/T25887—2010 奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法 1范围 本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的PCR-RFLP检测技术。 本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 奶牛脊椎畸形综合征complexvertebralmalformationindairycattle；CVM 奶牛的一种常染色体隐性遗传病，主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡，患病特牛 主要症状表现为：颈短、脊椎畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。 3.2 SLC35A3基因SLC35A3gene 定位于牛第3号染色体上，在基因序列数据库（GenBank）中的登录号为AY160683，全长14901bp， mRNA为981bp，由7个外显子和6个内含子组成，该基因编码核糖转运蛋白，与脊柱发育有关，是奶牛 脊椎畸形综合征的致病基因。 3.3 限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP 检测DNA用限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变 异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间 的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。 4原理 SLC35A3基因第四外显子中第559位碱基由G突变为T时，其对应编码的氨基酸由缬氨酸改变 为苯丙氨酸，导致奶牛脊椎畸形综合征的发生。采用PCR-RFLP技术检测牛样本基因组DNA变异，即 采用PCR技术扩增SLC35A3基因片段，限制性内切酶消化PCR扩增产物，电泳检测酶切产物，对 SLC35A3基因进行分型，根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因。 5扩增SLC35A3基因片段的引入酶切位点PCR引物 5'CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA 3 5'GCTCTCCTCTGTAATCCCCA 3 预期扩增长度为225bp。 GB/T25887—2010 6试剂和仪器 6.1主要试剂 水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。 TagDNA聚合酶及PCR缓冲液、RsaI限制内切酶及1OX酶切缓冲液、蛋白酶K,DNA分子质量 标记购自试剂公司。 TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、PBS缓冲液、加样缓冲液、10%过硫酸铵、30%丙烯酰胺、 10%聚丙烯酰胺、漠化乙锭、10%SDS、1mol/LTris-HCl、0.5mol/LEDTA（pH8.0）、三氯甲烷/异戊 醇（24：1）、3mol/L乙酸钠、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。 6.2主要仪器 冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水 浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。 7检测步骤 7.1牛基因组DNA 制备 采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组DNA。4℃冰箱中保存备用。 7.2PCR扩增及其产物检测 20μLPCR反应体系:0.4μmol/L引物、0.2mmol/LdNTP、待测DNA85ng~100ng、1UTaq DNA聚合酶、10XPCR缓冲液，加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。 PCR反应条件：94℃变性3min，35个循环（94℃30s，65℃30s,72℃30s)，72℃延伸10min， 4℃保温2min~10min。 (EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结果示意图见附录B中的图B.1。 7.3酶切及其产物检测 取16μLPCR扩增产物，加人5U限制内切酶RsaI和2μL10X酶切缓冲液，加水至20μL,反应 条件参见产品说明书。 10%~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（3V/cm5V/cm，电泳3h~4h），银染（染色方法参见附录C）。 酶切图谱见附录B中的图B.2。 7.4结果判定 由于24bp的条带太小，以致在10%～12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时显示不出来，但可根据 225bp、201bp条带进行样本基因型判定。 健康奶牛：基因型为GG型，即出现201bp一条电泳带； 隐性携带者：基因型为GT型，即出现225bp、201bp两条电泳带； CVM患者：基因型为TT型，即出现225bp一条电泳带。 2 GB/T 25887—2010 附录A （资料性附录） 主要试剂及配制方法 表A.1 主要试剂及配制方法 试剂 配制方法 TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0) 242gTris碱，57mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加双蒸水定容至 50XTAE缓冲液 1000mL，使用时50倍稀释 10%过硫酸铵 称取1g过硫酸铵溶于8mL双蒸水，定容至10ml 54.0gTris碱，27.5g硼酸.20mL0.5mmol/LEDTA（pH8.0)加双蒸水定容至 5XTBE缓冲液 1000mL，使用时5倍稀释 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉 300mL双蒸水中溶解145g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水定容至 双丙烯酰胺=29：1) 500mL 量取9.3mL30%丙烯酰胺，18.5mL双蒸水，7mL5×TBE，0.23mL10%过硫酸 10%聚丙烯酰胺 铵.0.02mLTEMED 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝（质量浓度），40%蔗糖（质量浓度） 100mL双蒸水中加人0.1gEB(10mg/mL)，搅拌使完全溶解，转人棕色试剂瓶， 溴化乙锭（EB) 锡箔包裹 氯化钠8g.磷酸氢二钠1.44g氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g加双蒸水定容至 PBS缓冲液 1000mL，调pH值至7.0，高压灭菌，室温保存 10%SDS 称取50gSDS加热溶于400mL双蒸水中，定容至500mL，高压灭菌，室温保存 称取121.4gTris碱溶于800mL双蒸水中，加浓盐酸调至pH8.0,定容到1000mL， 1 mol/L Tris-HCI 高压灭菌，室温保存 称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠溶于800mL双蒸水中，加入氢氧化钠（约 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20g）调至pH8.0，定容到1000mL.高压灭菌，室温保存 三氯甲烷/异戊醇（24：1) 量取480mL三氯甲烷，加人20mL异戊醇，混匀 称取408.1g三水乙酸钠溶于800mL双蒸水中，用乙酸调至pH5.2.加水定容至 3mol/L乙酸钠 1000mL，高压灭菌，室温保存 固定液 450mL双蒸水中加人50mL乙醇 脱色液 492.5mL双蒸水中加人7.5mL浓硝酸 染色液 500mL双蒸水中溶解1g硝酸银，置棕色瓶中保存 500mL双蒸水中溶解15g无水碳酸钠，加人1.32mL甲醛（0.046%），用双蒸水定 显影液 容至1000mL 停显液 485mL双蒸水中加入15mL冰乙酸 3